FOXK1通过上皮间充质转化促进胃癌浸润转移研究

卢洪胜，於樱枝，牟樱红，潘黎明，曹学全，包卫光，章辉

叉头框（FOX）基因家族为一类转录因子家族，共包含43个成员。FOX基因家族1类包括FOXA.G、I-L及Q亚家族，其在碳端有一个基本结构域；而FOXH及FOXM-P则归属于FOX基因家族2类。本研究的研究对象为FOX基因家族中的一员－FOXKl，其编码的蛋白与鼠肌细胞核因子（MNF）/FOXKl有高度的同源性。上皮间充质转化（EMT）是指具有极性的上皮细胞在一定的生理或病理情况下向具有移行能力的间充质细胞发生转化的过程。现代研究发现，发生EMT时E-钙黏素蛋白（E-cadherin）表达减少，而获得间质细胞特性，如波形蛋白（Vimentin）等蛋白表达上调，细胞黏附能力下降，迁移能力增加，更易于侵袭转移[1-2]。本研究应用组织芯片及免疫组化技术检测胃癌组织FOXKl及EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的表达情况，探讨其在胃癌中的表达意义。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集浙江省台州市中心医院2013年1月至2017年7月胃癌手术患者88例，其中男58例，女30例；平均年龄（66.26±12.35）岁，≤60岁26例，＞60岁62例；肿瘤直径≤5cm60例，＞5cm 28例。根据胃癌的不同分化程度和不同分期程度：高分化9例，中分化30例，低分化49例；T分期，T1期9例，T2期12例，T3期2例，T4期65例；N分期，N0期19例，N1期14例，N2期21例，N3期34例；TNM分期，Ⅰ期为10例，Ⅱ期25例，Ⅲ期52例，Ⅳ期1例。

1.2 方法

1.2.1 组织芯片 采用自主研发的一次成型组织芯片制作技术制作芯片蜡块。先对供体蜡块进行切片并HE染色，显微镜下定位，再在供体蜡块对应位置获取组织芯，然后将获得的组织芯按相对正常组织、癌灶组织配对依次排入铜质模具的7×9阵列孔内。每例设两个重复点，放入65℃烤箱内烤约10min（蜡芯表面微融化），取出后马上注入65℃的包埋石蜡，然后取出垫片均匀用力按下阵列孔铜板将组织芯顶起。之后，在承蜡槽上放入包埋盒并加满石蜡，最后将模具放入4℃冰箱或冷空调口快速冷却，冷却后即可取出组织芯片蜡块。以4m厚度连续切片，敷贴于专用防脱载玻片上。

1.2.2 免疫组化 所用标本经甲醛固定，石蜡包埋组织，经制作芯片后依次切片，其中常规HE染色1张，免疫组化切片3张，采用EnVision二步法。所用试剂FOXKl抗兔多克隆抗体，购自中山公司，抗体浓度为1∶200，E-cadherin、Vimentin为单克隆抗体，购自福建迈新公司，抗体浓度均为1∶100。

1.2.3 结果判读 染色结果根据染色强度及阳性表达细胞百分数进行半定量分析，FOXKl以细胞核中见到棕黄色颗粒分布为阳性，E-cadherin、Vimentin分别以细胞膜和浆中见到棕黄色颗粒分布为阳性。染色强度判断标准为：不着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分。阳性细胞百分数判断标准：每个视野计数100细胞，阳性细胞百分数＜5%为0分，5%～25%记为1分，25%～75%为2分，75%为3分。染色强度分值和阳性细胞百分数分值相乘即为每张染色切片的最终得分，0～1分判为阴性，2～4分低表达组，6～9分为高表达组。

1.3 统计方法 采用SPSS17.0软件进行分析，计数资料以率表示，采用2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FOXK1在胃癌组织及正常对照中标记结果比较 FOXK1在胃癌组织中表达为96.59%（85/88）（封二彩图4～5），在正常胃黏膜中表达为7.95%（7/88），胃癌组织中FOXK1表达显著高于正常胃黏膜（x2=138.56，P ＜ 0.01）。

2.2 FOXK1与胃癌临床病理特征的关系 FOXK1蛋白表达量在胃癌分化程度、肿瘤T分期、肿瘤N分期、肿瘤TNM分期中差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表 1。

2.3 FOXK1与EMT标记物E-cadherin、Vimentin的相关性 Spearman相关性分析显示，FOXK1与E-cadherin表达呈负相关（r=－0.21，P＜ 0.05），与Vimentin表达呈正相关（r=0.63，P＜ 0.05）。

3 讨论

表1 FOXK1表达与胃癌临床病理因素及E-cadherin、Vimentin的关系

图4 组织芯片显示高分化胃癌HE染色（HE，×100）

图5 组织芯片显示FOXK1在中分化胃癌表达（En Vision法，×50）

胃癌是我国第二大高发恶性肿瘤，发病率为679.1/10万人年，仅次于肺癌，且预后差，死亡率高[3]。胃癌的发生发展是一个多方面因素综合影响下的复杂生物学过程，涉及癌基因的激活、抑癌基因的失活及众多分子水平上的改变。近年来，随着诊疗技术的进步，早期胃癌患者5年生存率已显著提高，但伴有淋巴结转移或远处转移的胃癌患者预后仍然没有明显改善，成为死亡率高的重要原因。由此可见，胃癌进展已经成为影响胃癌患者的疗效及获得长期生存的关键问题。

FOX基因参与肿瘤多种恶性生物学表型的调控，FOXK1为其中一员，属于转录因子。近年来陆续有研究报道，Okada等[4]研究发现，FOXM1通过诱导VEGF生成，进一步促使胃癌中血管形成而至进展；Wang等[5]研究表明，FOXK1和FOXK2通过Wnt/-catenin信号系统将DVL转移到细胞核，导致肿瘤恶性程度增加；Xie等[6]发现FOXK1在RUFY3过表达细胞株里逆转EMT过程，表明RUFY3-FOXK1轴在肠癌的浸润转移中起重要作用。本研究发现FOXK1在胃癌组织中的表达水平远远高于正常胃黏膜，且分化程度越低，以及T分期、N分期、TNM分期越高，FOXK1蛋白表达量越高，这表明FOXK1介导了胃癌的发生发展过程。对于FOXK1介导的机制也做了初步探究和分析，由于EMT过程伴随着E-cadherin蛋白表达量减低及 Vimentin表达的增加，促进肿瘤细胞的迁徙和转移[7]。笔者进一步做FOXK1与EMT相关性研究，结果为FOXK1高表达显示上皮细胞标志物E-cadherin表达下调，间质细胞标志Vimentin表达上升，表明FOXK1过表达促进了胃癌细胞的EMT，引起胃癌浸润转移。

终上所述，FOXK1检测有助于评估胃癌的生物学行为和预后，初步表明通过介导EMT促进胃癌浸润和转移，但需要进一步细胞学和动物实验加以验证。

参考文献：

[1]PinoMS, Kikuchi H,Zeng M,et a1.Epithelial to mesenchymal transition is impaired in colon cancer cells with microsatellite instability[J].Gastroenterology,2010,138(4):1406-1417．

[2]Kalluri R,Weinberg RA.The basics of epithelial-mesenchymal transition[J].J Clin Invest,2009,119(6):1420-1428．

[3]Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancerstatistics in China,2015[J].CA Cancer Journal for Clinicians,2016,66(2):115.

[4]Okada K,Fujiwara Y,Takahashi T,et al.Over expression of forkhead box M1transcription factor(FOXM1)is a potential prognostic marker and enhances chemoresistance for docetaxel in gastric cancer[J].Annals of Surgical Oncology An Oncology Journal for Surgeons,2013,20(3):1035-1043.

[5]Wang W,Li X,Lee M,et al.FOXKs promote Wnt/-catenin signaling by translocating DVL into the nucleus[J].DevCell,2015,32(6):707-718.

[6]Xie R,Wang J,Liu X,et al.RUFY3 interaction with FOXK1 pro motes invasion and metastasis in colorectal cancer[J].Sci Rep,2017,7(1):3709.

[7]He C,Wang Z,Zhang L,et al.A hydrophobic residue in the TALE homeodomain of PBX1 promotes epithelial-to-mesenchymal transition of gastric carcinoma[J].Oncotarget,2017,8(29):46818-46833.