下调TPX2表达对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究

郏爱华，金健，王彦秋，彭慧芳

河南科技大学第一附属医院1妇产科，2神经分子实验室，河南 洛阳 471000

卵巢癌是女性生殖系统的恶性肿瘤，具有早期发病隐匿、进展速度快等特点，其发病率和病死率在全部妇科肿瘤中位居前列[1]。卵巢癌细胞恶性增殖、凋亡减少是卵巢癌发生和发展的重要基础，而卵巢癌的发病机制较为复杂，癌基因过度表达、抑癌基因表达缺失是卵巢癌发生的关键[2]。Xklp2靶蛋白（targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2，TPX2）与微管蛋白有关，在生物机体细胞中心体的功能发挥中具有重要作用，其在多种肿瘤中异常表达，在肿瘤组织中的表达水平高于正常组织[3-4]。有研究显示，TPX2参与膀胱癌、宫颈癌等肿瘤细胞的增殖与调控，在肿瘤细胞的增殖过程中发挥促进作用，下调TPX2表达可以抑制肿瘤细胞的增殖[5-6]。目前，关于TPX2表达下调对卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响尚不明确，本研究以卵巢癌细胞为研究对象，通过细胞转染TPX2小干扰RNA下调细胞中TPX2的表达，并通过MTT比色法、细胞克隆实验等方法明确TPX2表达下调对卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响，以期为研究卵巢癌的发病机制奠定基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞

卵巢癌细胞SKO-V3购自中国医学科学院细胞库。

1.2 仪器与试剂

实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time-PCR，qRT-PCR）试剂盒购自大连Takara生物工程公司；；cDNA合成试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）单克隆抗体购自美国Epitomic公司；TPX2单克隆抗体购自美国Santa公司；TPX2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由南京金斯瑞公司合成；TPX2 siRNA和siRNA control购自英国Abbexa公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3）单克隆抗体购自上海碧云天生物技术公司；信号转导与转录因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）、磷酸化的STAT3（p-STAT3）单克隆抗体购自美国Abacm公司；增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）单克隆抗体购自美国Sigma公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 细胞分组及培养

SKO-V3采用含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液培养，用0.25%的胰蛋白酶消化进行传代培养。SKO-V3浓度约为60%时，在细胞中转染TPX2 siRNA和siRNA control，分别作为干扰组和阴性组，同时以不作转染的细胞作为对照组。各组细胞转染并培养48 h后，分别采用qRT-PCR和蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞中TPX2 mRNA和TPX2蛋白的表达水平，步骤见1.4.1和1.4.2。

1.4 实验方法

1.4.1 qRT-PCR检测 对照组、阴性组和干扰组细胞在转染后48 h，采用Trizol法提取细胞中的RNA，步骤按照RNA提取试剂盒说明书操作。提取的RNA使用无核糖核酸酶水溶解，保存在-80℃温度下。吸取RNA样品，采用微量核酸定量仪测定波长为260 nm和波长为280 nm时光密度（optical density，OD）的比值，比值范围为1.8～2.0说明提取的RNA质量较好。使用cDNA合成试剂盒合成cDNA，步骤参照试剂盒说明书进行操作。采用qRT-PCR技术检测TPX2 mRNA的水平，以GAPDH为内参基因，采用相对定量法计算，用2-△△Ct计算TPX2 mRNA的水平。TPX2上游引物为5'-ACCTTGCCCTACTAAGATT-3'，下 游 引 物 为 5'-AATGTGGCACAGGTTGAGC-3'。GAPDH上游引物为 5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3-3'，下游引物为5'-GGGGTCATTGATAACAACAATA-3'。PCR反应体系按试剂盒说明书操作，反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，共进行40个循环。实验重复3次，取均值。

1.4.2 Western blot检测 转染后48 h，对照组、阴性组和干扰组提取细胞总蛋白，步骤参照蛋白浓度提取试剂盒说明书进行操作，用BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品和上样缓冲液混合后于100℃煮沸5 min。采用10%的分离胶和5%的浓缩胶进行电泳。每孔中添加40 μg蛋白，在110 V条件下电泳2 h。取出凝胶，在90 V、4℃的条件下把蛋白转移至NC膜上，转膜时间为90 min。封闭：5%胎牛血清白蛋白，室温孵育60 min。一抗孵育：将NC膜放置在1∶900稀释的一抗中，4℃孵育过夜。二抗孵育：将NC膜放置在1∶3000稀释的二抗中，室温条件下反应1 h。DAB显色，曝光后，用Quantity one分析目的条带及内参GAPDH的灰度值。目的蛋白水平=目的条带灰度值/GAPDH灰度值。实验重复3次，取均值。

1.4.3 MTT比色法实验 将对照组、阴性组和干扰组细胞接种到96孔板中，每个孔中加入3000个细胞，100 μl细胞培养液，每组设5个重复孔，孵育48 h。在每个孔中添加MTT溶液20 μl，放置于37℃、5%CO2的培养箱中反应4 h，将孔内的液体吸除干净后，每个孔中添加150 μl的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，孵育振荡反应10 min，用全自动酶标仪检测492 nm处的OD值。实验重复3次，取均值。

1.4.4 平板克隆实验 将对照组、阴性组和干扰组细胞种植到平皿中，于每个平皿中加入200个细胞，细胞液体积为10 ml，放置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育12 h后，肉眼可以观察到细胞克隆出现，采用4%的多聚甲醛固定，吉姆萨染色后，干燥，计算克隆形成数目和克隆形成率。实验重复3次，取均值。克隆形成率=（克隆形成数目/接种细胞总数）×100%。

1.4.5 流式细胞术检测 对照组、阴性组和干扰组细胞培养48 h后，用胰蛋白酶消化细胞，收集各组细胞，在细胞中加入冰预冷的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗细胞后，与500 μl结合缓冲液混匀，再加入膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）各5 μl，在避光、室温条件下孵育20 min。立即用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复3次，取均值。

1.4.6 Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平检测 对照组、阴性组和干扰组的细胞培养48 h后，提取细胞蛋白，采用Western blot法检测细胞中 Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白的表达水平。Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA以GAPDH为内参，计算目的蛋白灰度值与GAPDH灰度值的比值；p-STAT3以STAT3为内参，计算p-STAT3/STAT3比值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染TPX2 siRNA后细胞中TPX2 mRNA、TPX2蛋白的表达水平

转染TPX2 siRNA后，对照组、阴性组和干扰组细胞中TPX2 mRNA的表达水平分别为（1.00±0.12）、（1.02±0.09）、（0.21±0.02），3组比较，差异有统计学意义（F=225.988，P﹤0.05）；对照组、阴性组和干扰组细胞中TPX2蛋白的表达水平分别为（1.15±0.13）、（1.13±0.12）、（0.36±0.04），3组比较，差异有统计学意义（F=55.505，P﹤0.05）。阴性组与对照组细胞中TPX2 mRNA和TPX2蛋白的表达水平比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。干扰组细胞中TPX2 mRNA和TPX2蛋白的表达水平明显低于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（图1）

图1 Western blot法检测转染后3组细胞中TPX2的表达

2.2 下调TPX2对细胞增殖和克隆形成能力的影响

对照组、阴性组和干扰组细胞的OD值分别为（0.85±0.06）、（0.84±0.08）、（0.46±0.05），3组比较，差异有统计学意义（F=35.592，P﹤0.01）；对照组、阴性组和干扰组的细胞克隆形成率分别为（41.36±0.42）%、（40.69±0.51）%、（26.54±0.22）%，3组比较，差异有统计学意义（F=1300.177，P﹤0.01）。阴性组与对照组细胞的OD值和克隆形成率比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。干扰组细胞的OD值和克隆形成率均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。

2.3 下调TPX2对细胞凋亡的影响

对照组、阴性组和干扰组的细胞凋亡率分别为（9.24±0.84）%、（9.32±0.80）%、（33.51±3.12）%，3组比较，差异有统计学意义（F=158.962，P﹤0.01）。阴性组与对照组的细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）。干扰组的细胞凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义（P﹤0.01）。（图2）

图2 下调TPX2对细胞凋亡的影响

2.4 下调TPX2对细胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平的影响

对照组、阴性组和干扰组细胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA和 p-STAT3/STAT3蛋白的表达水平比较，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。阴性组与对照组细胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。干扰组细胞中Cleaved Caspase-3水平明显高于对照组，而Bcl-2、PCNA、p-STAT3/STAT3水平明显低于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（图3、表1）

图3 下调TPX2对细胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平的影响

3 讨论

TPX2在哺乳动物微管相关蛋白的调控过程中发挥着重要的作用，能够作用于着丝粒，从而影响微管的形成、组装及细胞的有丝分裂[7]。近年来的研究显示，非小细胞肺癌细胞染色体20q11.2持续扩增导致TPX2的表达水平升高，同样在胰腺导管癌中发现TPX2 mRNA和TPX2蛋白过度表达，推测TPX2可能是肿瘤治疗和诊断的潜在靶点[8-9]。在膀胱癌细胞T24中抑制TPX2表达后，膀胱癌细胞的增殖速度降低，并且细胞的凋亡率升高，细胞中Caspase的活化水平也提高[10]。本研究结果显示，下调TPX2表达后，卵巢癌细胞的增殖和克隆形成能力均下降，而细胞凋亡率升高，说明下调TPX2表达可以发挥抑制卵巢癌细胞增殖的作用，诱导卵巢癌细胞凋亡。

表1 下调TPX2后各组细胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平的比较（±s）

表1 下调TPX2后各组细胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平的比较（±s）

组别对照组阴性组干扰组F值P值Bcl-2 0.95±0.08 0.93±0.12 0.21±0.03 73.714 0.000 Cleaved Caspase-3 0.40±0.06 0.41±0.07 1.04±0.10 65.400 0.000 PCNA 0.74±0.08 0.75±0.07 0.26±0.03 57.861 0.000 p-STAT3/STAT3 0.85±0.06 0.84±0.04 0.13±0.02 273.911 0.000

细胞的增殖与凋亡是一个复杂的过程，受多种基因的严格调控，是细胞内多种因子共同作用的结果[11]。Caspase级联反应参与细胞凋亡，是目前研究较为透彻的与细胞凋亡有关的蛋白家族，其含有多个蛋白成员，根据其作用的不同可以分为凋亡起始因子、执行因子等，其中，Caspase-3在细胞凋亡中发挥凋亡执行的作用，其活化形成Cleaved Caspase-3后，标志着细胞凋亡进入不可逆的阶段[12]。Bcl-2是Bcl-2蛋白家族的成员，其表达水平升高后可以抑制细胞凋亡的发生[13]。PCNA存在于增殖细胞中，与细胞内的DNA合成有关，其表达水平的高低可以反映细胞的增殖状态[14]。有研究显示，卵巢癌组织中Bcl-2水平升高，Cleaved Caspase-3水平降低，PCNA水平升高，PCNA、Caspase-3水平的高低与卵巢癌细胞的增殖和凋亡有关[15-16]。本研究显示，下调TPX2后的卵巢癌细胞中PCNA和Bcl-2水平下降，细胞中Cleaved Caspase-3水平升高，说明下调TPX2可能通过诱导Caspase-3活化、抑制Bcl-2表达从而诱导卵巢癌细胞凋亡，通过降低PCNA的表达水平抑制卵巢癌细胞的增殖。

细胞内存在多种信号转导通路，这些信号转导通路在细胞正常生物学特性的发挥中具有重要作用[17]。STAT3信号通路在生命体正常的组织和器官中均有表达，其磷酸化水平升高后可以促进细胞的增殖，减少细胞的凋亡[18]。在卵巢癌、宫颈癌等多种肿瘤组织中均发现STAT3信号通路过度激活，阻断STAT3信号通路后可以诱导肿瘤细胞凋亡[19-20]。本研究结果显示，下调TPX2表达可以阻断STAT3的磷酸化，抑制STAT3信号通路的激活，这提示下调TPX2表达可能通过抑制STAT3信号通路的激活从而诱导卵巢癌细胞凋亡。

综上所述，下调TPX2表达可以降低卵巢癌细胞的增殖和克隆形成能力，诱导卵巢癌细胞凋亡，诱导细胞中Caspase-3活化，抑制细胞中Bcl-2、PCNA的表达和STAT3信号通路的激活。TPX2可能是治疗卵巢癌的潜在靶点，这为卵巢癌发病机制的研究奠定了基础，但对于其具体的作用机制仍然需要进一步深入的探讨。

参考文献

[1]Claus EB,Schildkraut JM,Thompson WD,et al.The genetic attributable risk of breast and ovarian cancer[J].Cancer,1996,77(11):2318-2324.

[2]Negri E,Tzonou A,Beral V,et al.Hormonal therapy for menopause and ovarian cancer in a collaborative re-analysis of European studies[J].Int J Cancer,1999,80(6):848-851.

[3]Gupta A,Jain R,Wahi D,et al.Abrogation of AuroraATPX2 by novel natural inhibitors:molecular dynamicsbased mechanistic analysis[J].J Recept Signal Transduct Res,2015,35(6):626-633.

[4]Niu H,Gong L,Tian X,et al.Low expression of miR-491 promotes esophageal cancer cell invasion by targeting TPX2[J].Cell Physiol Biochem,2015,36(6):2263-2273.

[5]李美玲,张业玲,丁晓,等.人宫颈癌Hela细胞TPX2基因沉默对放射敏感性的影响[J].山东医药,2017,57(2):47-49.

[6]Yan L,Li S,Xu C,et al.Target protein for Xklp2(TPX2),a microtubule-related protein,contributes to malignant phenotype in bladder carcinoma[J].Tumour Biol,2013,34(6):4089-4100.

[7]Wei JH,Zhang ZC,Wynn RM,et al.GM130 regulates golgi-derived spindle assembly by activating TPX2 and capturing microtubules[J].Cell,2015,162(2):287-299.

[8]Schneider MA,Christopoulos P,Muley T,et al.AURKA,DLGAP5,TPX2,KIF11 and CKAP5:five specific mitosisassociated genes correlate with poor prognosis for nonsmall cell lung cancer patients[J].Int J Oncol,2017,50(2):365-372.

[9]Warner SL,Stephens BJ,Nwokenkwo S,et al.Validation of TPX2 as a potential therapeutic target in pancreatic cancer cells[J].Clin Cancer Res,2009,15(21):6519-6528.

[10]闫亮.TPX2在膀胱癌发生发展中的作用及其初步分子机制研究[D].郑州:郑州大学,2014.

[11]于洋洋,梁明辉.丹皮酚对肝癌细胞增殖凋亡及JAKSTAT信号通路的影响[J].中国老年学,2017,37(7):1591-1593.

[12]Yang CS,Matsuura K,Huang NJ,et al.Fatty acid synthase inhibition engages a novel caspase-2 regulatory mechanism to induce ovarian cancer cell death[J].Oncogene,2015,34(25):3264-3272.

[13]Koukourakis MI,Giatromanolaki A,O’Byrne KJ,et al.Potential role of bcl-2 as a suppressor of tumour angiogenesis in non-small-cell lung cancer[J].Int J Cancer,1997,74(6):565-570.

[14]Li X,Liu X,Cui D,et al.Clinical significance of nucleostemin and proliferating cell nuclear antigen protein expression in non-small cell lung cancer[J].J BUON,2015,20(4):1088-1093.

[15]银铎,刘彤.卵巢上皮性肿瘤组织中Caspase-3,bcl-2的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系[J].中国现代医学杂志,2004,14(8):55-58.

[16]Dias MC,Furtado KS,Rodrigues MA,et al.Effects of Ginkgo biloba on chemically-induced mammary tumors in rats receiving tamoxifen[J].BMC Complement Altern Med,2013,13:93.

[17]De Simone V,Franzè E,Ronchetti G,et al.Th17-type cytokines,IL-6 and TNF-α synergistically activate STAT3 and NF-kB to promote colorectal cancer cell growth[J].Oncogene,2015,34(27):3493-3503.

[18]Jiang J,Li Z,Yu C,et al.MiR-1181 inhibits stem cell-like phenotypes and suppresses SOX2 and STAT3 in human pancreatic cancer[J].Cancer Lett,2015,356(2 Pt B):962-970.

[19]陈亮,盛修贵.IL-6/STAT3信号通路与卵巢癌关系研究进展[J].中华肿瘤防治杂志,2015,22(15):1253-1256.

[20]方禛浩,谌錾,李妍静,等.NF-κB和STAT3对宫颈癌作用的研究进展[J].中国妇产科临床杂志,2013,14(1):81-83.