“α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测”实验探讨*

夏 天 （浙江省余姚市第四中学 浙江余姚 315400）

“α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测”是浙科版高中生物学选修1 第2 部分 “酶的应用”中的实验［1］。按照教材的步骤进行实验，淀粉溶液经固定化酶柱后的流出液遇KI-I2溶液不变色或呈浅黄色。 这可能由于过柱的流速过慢，淀粉水解反应过于充分所致。 因为α-淀粉酶作用于淀粉内的α-1，4-糖苷键，水解淀粉产生糊精、低聚糖、麦芽糖和葡萄糖等［2］。因此，在教学前，教师应根据α-淀粉酶的活性进行预实验，摸索适宜的实验条件。

1 实验装置和试剂的配制

用5 mL 塑料注射器的外套、输液器的管路和流量调节器组建实验装置，并固定于铁架台上［3］（图1）。 使用输液器的流量调节器代替夹子，便于控制过柱的流速。

0.05 %可溶性淀粉溶液配制：取50 mg 可溶性淀粉溶于100 mL热水中，搅拌均匀，加热至透明、 无沉淀，即制成淀粉胶体，冷却后备用。溶液的配制可按比例放大。

2 实验过程和结果

2.1 α-淀粉酶的固定化 实验温度为30℃。 在烧杯中将5 mg α-淀粉酶溶于4 mL 蒸馏水中。 再加入5 g 石英砂，缓慢搅拌10 min［3］，使α-淀粉酶吸附到石英砂上。将剪成合适大小的圆形滤纸片放入注射器外套底部，作为筛板（防止石英砂漏出）。 将吸附α-淀粉酶的石英砂装入注射器外套（图1），体积约为4 mL。用5 倍柱体积（20 mL）的蒸馏水洗涤固定化酶柱，除去未吸附的α-淀粉酶，调节流量调节器，流速为1 mL/min，约20 滴／min。

蒸馏水洗涤酶柱约5 mL 后，取1 支试管，加入5 滴流出液，再加入1 mL 可溶性淀粉溶液，混匀，反应3 min，加入2 滴KI-I2溶液，溶液不变色，说明流出液中含有α-淀粉酶（图2B，本文图2、图3 见封四）；蒸馏水洗涤酶柱约20 mL 后，再取1 支试管，加入5 滴流出液，再加入1 mL 可溶性淀粉溶液，混匀，反应3 min，加入2 滴KI-I2溶液，溶液呈蓝色，说明流出液中已不含α-淀粉酶（图2C），可以进行后续实验。以1 mL 可溶性淀粉溶液中加入2 滴KI-I2溶液作为对照（图2A）。

2.2 固定化α-淀粉酶水解淀粉 实验温度为30℃。 将流量调节器流速调节为12 滴/min，用滴管滴加0.05%可溶性淀粉溶液。在流出5 mL 溶液后，取1 支试管接收1 mL 流出液，加入2 滴KI-I2溶液，混匀，溶液呈红色（紫红色）（图3A），表明淀粉被水解为糊精。用蒸馏水稀释1 倍后观察，则红色变浅（图3B）。 以淀粉溶液中加入2 滴KI-I2溶液作为对照（图3）。

2.3 酶柱的保存和重复使用 实验后，用40 mL蒸馏水洗涤酶柱，取1 支试管接收1 mL 流出液，加入2 滴KI-I2溶液，溶液无颜色变化，表明酶柱没有残留淀粉或糊精。放置于4℃冰箱中保存。3 d 后再重复实验，实验结果与第1 次相同，表明固定化酶具有可重复使用的优点。

3 结语

本实验通过对实验条件和步骤的优化，使实验现象明显，实验时间缩短，且让实验更易操作。主要体现在以下3 个方面： ①量化试剂用量。 例如，洗涤酶柱的蒸馏水用量换算为具体体积；液体的过柱流速以滴/min 为单位，方便计量。 ②用于洗去未吸附的α-淀粉酶的蒸馏水用量为20 mL（教材中为40 mL），节约了实验时间。 ③淀粉溶液的过柱流速由“6 滴/min（0.3 mL/min）”调整为“12 滴/min”。徐平珍［4］实验表明，流速控制在10～20 滴/min，则流出液遇KI-I2溶液呈红色。 但预实验是必不可少的，由于酶活性的不同，得到明显实验现象的流速会不同。 例如，本实验中若流速为20 滴/min，则流出液遇KI-I2溶液呈蓝色。