姜黄素长循环脂质体的制备及表征

任婧 张丹参 侯文书 武春阳 马佳呈

摘 要：为了改善姜黄素长循环脂质体（Cur-LCL）的稳定性，延长药物在体内的循環时间，对现有姜黄素脂质体（Cur-Lips）和姜黄素长循环脂质体的制备方法进行了优化。使用乙醇注入法制备Cur-Lips，用后插法将DSPE-PEG2000插入Cur-Lips中制成Cur-LCL。结果表明：Cur-LCL外观为圆形囊泡状球体，平均包封率为（88.91±0.94）%，4 ℃存放15 d包封率没有明显变化，平均渗漏率为2.4%，具有较好的稳定性;Cur-LCL平均粒径为（118.4±3.2）nm（n=3），呈单峰分布，平均电位为（-12.9±0.32）mV（n=3）;以溶解度为标准对溶出介质进行筛选，选择以1% Tween 80的生理盐水为体外释放试验的溶出介质，Cur原料药12 h基本释放完全，Cur-Lips在36 h基本释放完全，累计释放率为92.67%，Cur-LCL在72 h基本释放完全，累计释放率为91.36%。Cur-LCL具有明显的缓释性，可以延长药物在血液中的循环时间，达到长循环的效果。

关键词：中药药剂学;姜黄素;长循环脂质体;包封率;体外释放

中图分类号：R844.1 文献标志码：A

文章编号：1008-1542（2018）06-0532-08

姜黄素（Cur）[1]是从姜科植物姜黄、莪术、郁金等根茎中提取的一种天然黄色色素，是小分子植物酸性多酚，具有多种药理作用，且毒性很低[2-3]。近年来发现，姜黄素能抑制β淀粉样蛋白（Aβ）的合成与蓄积，改善阿尔茨海默病患者的空间学习记忆能力[4]。但是，姜黄素本身因水溶性差、生物利用度低、半衰期短、易降解[5]、不能通过血脑屏障等缺点而制约了自身的发展[6]。

脂质体可以将姜黄素包裹在脂质双分子层中，用于克服水溶性差和生物利用度低的问题[7-8]，而DSPE-PEG2000可以经后插法插入姜黄素脂质体（Cur-Lips）的磷脂双分子层中[9-11]，制成长循环姜黄素脂质体（Cur-LCL）。笔者对此进行了研究，修饰后的长循环脂质体可以避免静脉给药后血液中巨噬细胞对脂质体的吞噬作用，具有明显的缓释效果，可延长药物在体内的循环时间[12]，提高药物的稳定性，达到长循环的作用[7]。

1 实验部分

1.1 主要材料与仪器

姜黄素（西安小草植物科技有限责任公司提供，XC20160815）;姜黄素标准品（中国药品生物制品检定研究院提供，110823-201405）;蛋黄卵磷脂（上海艾韦特（A.V.T.）医药科技有限公司提供，PC-98T，注射级）;胆固醇（上海艾韦特（A.V.T.）医药科技有限公司提供，注射级）;DSPE-PEG2000（上海艾韦特（A.V.T.）医药科技有限公司提供，B50845，注射级）;葡聚糖G-50凝胶;乙腈（色谱纯）;冰醋酸（色谱纯）;其余试剂均为分析纯。

BT 224S电子天平，BT100-2J蠕动泵，RE201D旋转蒸发器，4-15高速离心机，ZEN3690粒度分析仪，e2695 高效液相色谱仪，H-7650 透射电镜，MODUL YOD-230真空冷冻干燥机，RC8MD溶出试验仪。

1.2 长循环姜黄素脂质体（Cur-LCL）的制备

采用乙醇注入法制备姜黄素脂质体[13-14]。分别精密称取姜黄素、蛋黄卵磷脂、胆固醇适量，溶解在少量无水乙醇中，超声助溶，于40 ℃水浴条件下将无水乙醇溶液滴加到去离子水中，水浴搅拌10 min，旋转蒸发除去无水乙醇，得到姜黄素脂质体（Cur-Lips）。精密称取DSPE-PEG2000适量，加入到Cur-Lips中，在EDC和NHS催化下于50 ℃孵育1 h，得到Cur-LCL。

1.3 处方工艺优化

1.3.1 单因素优化制备处方

以包封率为评价指标，进行单因素试验，分别考察投药量、胆固醇用量、无水乙醇用量和DSPE-PEG2000用量对Cur-LCL包封率的影响。

1.3.2 正交试验优化制备工艺

以包封率为评价指标，以水浴温度、搅拌速度、滴加时间和水合时间为因素进行正交试验，优化制备工艺，因素与水平见表1。

1.4 理化性质考察

1.4.1 包封率（ER）的测定

采用微柱离心法测量Cur-LCL的包封率。取适量Cur-LCL，滴加于葡聚糖G-50凝胶柱的顶端，离心收集滤液。用适量去离子水洗脱3次，合并滤液于容量瓶中破乳定容，测量吸光度，计算脂质体中包裹的药物含量：

1.4.2 形态

取适量Cur-LCL，滴在碳支持膜铜网表面上，静置2 min，使Cur-LCL充分吸附在铜网上。以2%（质量分数，下同）磷钨酸染液染色2 min，置于透射电镜下观察形态。

1.4.3 粒径与电位

取1 mL的Cur-LCL，加入9 mL去离子水稀释至10倍，使用马尔文粒度分析仪分别测定Cur-LCL的粒径和电位。

1.5 体外释放试验

1.5.1 溶出介质的选择

分别精密称取5份相同且过量的Cur原料药，加入到去离子水、PBS（pH值为7.4）、含1% Tween 80的PBS（pH值为7.4）、生理盐水、含1% Tween 80生理盐水中，于37 ℃下搅拌48 h，10 000 r/min离心3 min。取上清液测定Cur含量，选择对Cur溶解度较高的溶出介质作为体外释放实验的溶出介质。

1.5.2 溶出曲线的绘制[15]

分别取Cur-LCL，Cur-Lips和等量的游离Cur各3份，置于煮沸处理过的透析袋中，将透析袋封口，悬挂于200 mL的溶出介质中。水浴温度为37 ℃，转速为100 r /min，于0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，24，36，48，72 h 时各取样2 mL，同时补加2 mL溶出介质。将取出的溶液过0.22 μm微孔滤膜后，测定Cur含量，计算累计释放率，并绘制溶出曲线。

2 结果与讨论

2.1 处方工艺优化

2.1.1 单因素优化制备处方

通过对投药量、胆固醇用量、无水乙醇用量和DSPE-PEG2000用量进行考察，得到单因素试验结果，见图1。

脂质体内蛋黄卵磷脂负载能力有限[16]，当蛋黄卵磷脂的量固定不变时，投药量超过1.5 mg后包封率急剧下降，所以1.5 mg达到了脂质体当前可以包裹药物的负载上限。胆固醇可以增加脂质的流动性，改善脂质体的外观和包封率，但胆固醇量过大时会导致脂质体不稳定，胆固醇为10 mg时包封率较高。本试验用无水乙醇溶解药物和辅料，无水乙醇用量较少时会导致药物与辅料的浓度增高，在形成脂质体过程中容易包裹不均匀，造成包封率不高，无水乙醇用量达到3 mL及以上时脂质体包封率变化不大。

有学者研究发现，如果DSPE-PEG2000和蛋黄卵磷脂的质量比超过10%，DSPE-PEG2000将很难插入脂质体的磷脂双分子层，并且很容易与磷脂形成混合胶束[17-18]。故选取10%以内的比例进行试验，当DSPE-PEG2000与磷脂的质量比为7%时，包封率较高。

2.1.2 正交试验优化制备工艺

正交试验结果见表2。

根据正交试验的结果，各因素对包封率的影响顺序为因素C>因素A>因素D>因素B，制备Cur-LCL的适宜工艺为水浴温度40 ℃、搅拌速度300 r/min、水合时间10 min、滴加时间120 s。

2.2 理化性质

2.2.1 包封率的测定

分别在葡聚糖-G50凝胶柱顶端滴加Cur-LCL和同等浓度的游离Cur，离心收集滤液，破乳定容测量吸光度，再用适量去离子水洗脱19次，分别破乳定容测量吸光度，绘制洗脱曲线，如图2所示。

由图2可以看出，Cur-LCL和游离药物可以良好分离，且重复测定RSD值≤2%，说明微柱离心法适用于本试验的包封率测定。

按照较优处方制备工艺分别制备3批Cur-LCL，计算各组的包封率和载药量，结果如表3所示。由表3可从看出，平均包封率为88.91%，平均载药量为1.88%，RSD值均小于2%，说明制备方法稳定，重复性较好。于4 ℃保存7，10，15 d后再次测量包封率，结果见表4。

Cur-LCL在4 ℃条件下储存7 d时测量包封率，并无明显变化，10 d时脂质体包封率开始出现轻微下降，15 d时测量平均渗漏率为2.4%，证明Cur-LCL具有较好的稳定性。

2.2.2 透射电镜结果

透射电镜观察结果见图3。

由图3可以看出，Cur-LCL在2个倍数下均为圆球形囊泡结构，无明显黏连，未见聚集，分布比较均匀。

2.2.3 粒径与电位

Cur-Lips的粒径分布图见图4，Cur-LCL的粒径、电位分布图见图5和图6。由图4—图6可以看出：Cur-Lips平均粒径为（110.5±2.7）nm （n=3），Cur-LCL的平均粒径为（118.4±3.2）nm （n=3），粒径均呈单峰分布，分布比较均匀，可见加入的DSPE-PEG2000未使脂质体粒径明显增大;Cur-LCL 3次测量的平均电位为（-12.9±0.32）mV （n=3），电位绝对值较大，可以保证脂质体之间的排斥作用力，使脂质体较为稳定。

2.3 体外释放试验

2.3.1 溶出介质的选择

考察了5种溶出介质对姜黄素的溶解能力，结果如表5所示。根据Cur在各种溶出介质中的溶解度情况，选择溶解度较好的含1% Tween 80的生理盐水作为体外释放试验的溶出介质。

2.3.2 色谱条件

色谱柱：YWG-C18（4.6 mm×250 mm，10 μm）;流动相：乙腈-4%冰乙酸水溶液（二者体积比为48∶52）;流速：1 mL/min;柱温30 ℃;检测波长：430 nm;进样量10 μL。

2.3.3 标准曲线

精密称取姜黄素标准品适量，用释放介质溶液溶解，并依次稀释为0.1，0.5，1，2，5，10，20，50 μg/mL的溶液，用HPLC测量含量，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图7所示。图7表明，姜黃素质量浓度在0.1～50 μg/mL内线性关系良好。

2.3.4 精密度

分别配制10，30，50 μg/mL 3种质量浓度的姜黄素溶液，每天测量5次，连续测量5天，分别计算日内精密度和日间精密度。日内精密度的RSD值分别为1.23%，0.50%和0.41%，日间精密度的RSD值分别为1.70%，0.62%和0.46%，RSD值<2%。

2.3.5 回收率

分别配制10，30，50 μg/mL 3种质量浓度的姜黄素溶液，加入到1 mL空白脂质体中，破乳后测量姜黄素的质量浓度，计算回收率，结果见表6。由表6可以看出，回收率RSD值均<2%，说明辅料对Cur的含量检测没有影响。

2.3.6 稳定性

配制质量浓度为30 μg/mL的姜黄素溶液，每间隔2 h测量姜黄素的含量，测量10 h，考察姜黄素溶液的稳定性，结果见表7。由表7可以看出，姜黄素溶液在含1% Tween 80的生理盐水中稳定性良好。

2.3.7 体外释放率

Cur-LCL的体外释放曲线见图8。

试验结果表明：游离Cur在12 h内基本完全释放，累计释放率为96.27%，Cur-Lips在36 h时累计释放率达到92.67%;Cur-LCL则在72 h内基本释放完全，累计释放率为91.36%。这说明DSPE-PEG2000的修饰可以放慢脂质体的释放速度，其原因可能是DSPE-PEG2000在脂质体表面形成了一层水滑膜，减慢了药物的释放，从而达到缓释和长循环的效果[19-20]。

3 结 论

1）选用乙醇注入法制备姜黄素脂质体（Cur-Lips），将DSPE-PEG2000用后插法加入到姜黄素脂质体中，得到姜黄素长循环脂质体（Cur-LCL），平均包封率为（88.91±0.94）%，平均载药量为（1.88±1.10）%，4 ℃下储存15 d平均渗漏率为2.4%。

2）Cur-LCL外觀为圆形囊泡状球体，平均粒径为（118.4±3.2）nm （n=3），呈单峰分布，平均电位为（-12.9±0.32）mV（n=3），性质较为稳定，可以认为是制备姜黄素长循环脂质体的较好方法。

3）考察了Cur在不同介质中的溶解度，选定1% Tween 80生理盐水作为体外释放实验的溶出介质，原料药在12 h内基本完全释放，Cur-Lips在36 h内基本释放完全，累计释放率为92.67%，Cur-LCL在72 h内基本释放完全，累计释放率为91.36%，说明修饰了DSPE-PEG2000的Cur-LCL具有明显的缓释性。

4）在Cur-Lips表面修饰了DSPE-PEG2000，增加了脂质体的稳定性，延长了体外释放时间，使得药物在体内的作用时间更长;此外，因为理化性质更加稳定，所以更加便于药物的储存和运输。但脂质体普遍存在载药量偏低的问题，当投药量达到辅料负载能力的上限时，随着投药量的增加，载药量反而会下降，而脂质体使用的辅料大多为天然成分，负载能力有限，今后需针对脂质体载药量的提高加以深入研究。

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