菜心BclUBE2基因的克隆与表达分析

曾小玲 赵瑞丽 钟开勤 朱朝辉 陈敏氡

摘 要 采用同源克隆法从菜心中获得cDNA全长459 bp的E2基因，命名为BclUBE2。该基因编码153个氨基酸，分子量为17.24 ku，理论等电点为5.37，为亲水性非分泌蛋白。结构分析显示，该蛋白含有一个泛素结合酶E2活性位点、一个WD重复序列和一个高度保守的半胱氨酸。进化分析发现，菜心BclUBE2蛋白与芸薹属芜菁和油菜的亲缘关系较近。qRT-PCR分析表明，菜心BclUBE2基因在根、茎、叶、叶柄中均有表达，且表达丰度和变化趋势不同。在低温胁迫下，根中的表達量呈现先降低后升高的变化趋势，且在处理1 h时表达量最低；在茎、叶、叶柄中均呈现先升高后降低的表达趋势，茎和叶柄处理6 h时的表达量最高，叶片处理1 h时的表达量最高。说明菜心BclUBE2基因在响应低温胁迫中发挥作用。

关键词 菜心；BclUBE2基因；qRT-PCR

中图分类号 S634.5 文献标识码 A

Abstract The ubiquitin-conjugating enzyme E2 gene was cloned from Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee and designated as BclUBE2. The full cDNA length of BclUBE2 was 459 bp， encoding 153 amino acid residues with an estimated molecular mass of 17.24 ku and a calculated pI of 5.37. This protein was hydrophilic non-secretory. Structural analysis revealed that the sequence contained an E2 ubiqitin-conjugating enzyme active site， a WD-repeated sequence and a highly conserved cysteine. Phylogenetic analysis showed that BclUBE2 protein had the closest relationship with Brassica napus and Brassica rapa. qRT-PCR results showed that the existence of BclUBE2 was detectable in the root， stem， leaf and petiole with different expressive abundance and change trend. Under low temperature stress， the expression level in the root showed the trend of decreasing first and then increasing， and reached the lowest level at 1 h. However， the expression level in the stem， leaf and petiole increased first and then decreased with the highest level at 6 h in stem and petiole and at 1 h in leaf. These results indicated that BclUBE2 gene was involved in plant response to low temperature stress.

Keywords Brassica campestris L. ssp.chinensis var. utilis Tsen et Lee； BclUBE2 gene； qRT-PCR

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.014

菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）是十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，以花薹为食用产品的蔬菜，又名菜薹，是我国南方的特产蔬菜之一。菜心品质柔嫩，营养丰富，越来越受到人们的喜爱，其栽培面积越来越大。菜心喜温，温度过高或过低，会导致菜薹纤细，产量低，质量差。因此，研究菜心在低温胁迫下的反应，探究菜心自身抵御低温的能力，对培育出抗低温菜心品种具有重要意义。

泛素结合酶E2（ubiquitin conjugating enzyme E2）是将活化的泛素分子转移到靶蛋白，从而催化泛素降解途径的关键酶之一，决定泛素链的长度、拓扑结构、泛素化修饰的特异性、精确性和蛋白泛素化效率等[1-2]，在植物的整个生长发育和形态构建方面发挥重大作用[3]，如番茄泛素结合酶基因在叶片衰老过程中表达[4]；棉花GhUBC1/2 基因在叶片和花衰老时上调表达[5]；拟南芥AtUBC2 基因可通过激活抑制开花基因及相关功能基因的表达抑制开花[6]。E2蛋白在逆境胁迫过程中也发挥重要作用，如NbUbc2基因通过负调控抗病基因 SGT1的表达来提高本氏烟叶片的抗病性[7]；橡胶树HbUBC22能够响应乙烯胁迫反 应[8]；耐盐柽柳E2蛋白基因转烟草能够提高其耐旱性[9]；小白菜BcUBCE2基因在铜胁迫下表现出上调表达[10]；水茄StUBCc基因能够响应黄萎病菌诱导过程[11]。这些研究表明，E2基因能够直接或间接调控植物的生长发育和逆境反应过程。目前，关于菜心泛素结合酶E2基因功能的研究鲜少人报道。本研究通过同源克隆方法获得菜心BclUBE2基因的cDNA全长，分析其序列特征，同时分析该基因在不同时空的表达模式，以期为菜心耐低温机理研究奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供试菜心品种为福州市蔬菜科学研究所培育的“绿星菜心”品种，试验于2017年8—10月在福州市蔬菜科学研究所实验室进行。1.1.2 试剂 Trizol Up、EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStart? Top Green qPCR SuperMix 购自北京全式金生物技术有限公司，RevertAit First strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒购自 Thermo 公司，pMD-18T Vector、E. coli DH5α competent cells购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 材料处理 将菜心种子播种于盛有育苗基质的穴盘中育苗，待长至3～4片真叶时，选取长势一致的幼苗移至人工气候箱进行低温处理，温度为4 ℃、湿度60%、光照100%。低温处理0、1、3、6、12 h时采集根、茎、叶柄和第3片真叶（去除主叶脉），液氮速冻后放置-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2 总 RNA 提取与cDNA的合成 菜心总RNA提取参考Trizol 试剂说明书。琼脂糖凝胶电泳检测其完整性与纯度，选取无污染、无降解、条带清晰的RNA反转录成cDNA，cDNA的合成参考试剂盒EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的说明书。

1.2.3 基因全长的扩增与功能分析 参考NCBI网站发布的十字花科油菜（XM_013809488.2）、甘蓝（XM_013762644.1）、芜菁（NM_001301933.1、XM_009102991.2、KF148023.1）E2基因的核苷酸序列设计引物UE2-F、UE2-R扩增菜心BclUBE2蛋白基因ORF（表1），将获得的片段回收、纯化后送北京六合华大科技有限公司测序。

1.2.4 生物信息学分析 采用以下软件分析氨基酸序列：基本理化性质用Protparam（http：//web. expasy.org/protparam/）预测；疏水性用Protscale （http：//web.expasy.org/protscale/）默认算法（Hphob./ Kyte&Doolittle）预测；跨膜结构用TMHMM-2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测；信号肽用SignalP（http：//www. cbs. dtu.dk/ services/SignalP/）预测；二级结构应用SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_au?tomat.pl？ page=npsa_sopma.html）预测，功能位点用Expasy（http：//prosite.expasy.org/）分析。將获得的片段在NCBI上用 BLAST进行同源序列搜索，选取同源性、可靠性高的E2蛋白序列，应用DNAMAN和MEGA 5.2软件进行多序列比对和进化树的构建。

1.2.5 基因表达特性分析 将处理0、1、3、6、12 h时的根、茎、叶、叶柄的总RNA进行提取，反转录成cDNA，将其稀释至100 ng/ul作为 RT-PCR的模板。以菜心Actin基因为内参（actin-F、actin-R），根据菜心E2基因序列设计特异性引物（RTUE2-F、RTUE2-R）。参考北京全式金生物技术有限公司的TransStart? Top Green qPCR SuperMix试剂盒说明书进行荧光定量分析，采用公式：目的基因的相对含量=2CT 计算E2基因的相对表达量。

1.3 数据分析

采用EXCEL软件进行数据的基本处理，采用DPS软件进行单因素方差分析及差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 BclUBE2基因全长的克隆与分析

以UE2-F、UE2-R为引物进行PCR扩增，将目的片段进行回收测序，获得一个459 bp的菜心泛素结合酶E2基因的cDNA扩增片段（命名为BclUBE2）（图1），该序列编码153个氨基酸，含起始密码子ATG和终止密码子TAG（图2）。

2.2 生物信息学分析

BclUBE2基因编码的蛋白质的分子量为17.24 ku，理论等电点为5.37，所带Arg+Lys总数为16，Asp+Glu总数为18，为酸性蛋白。疏水性分析显示，该蛋白为亲水性蛋白，37位的天冬酰胺（N）疏水性最强，136位的谷氨酸（E）亲水性最强，不存在跨膜区和信号肽，为非分泌蛋白。该蛋白的二级结构以Alpha helix和Random coil为主，分别为38.16%和 38.82%，Extended strand和Beta turn相对较少，分别为18.42%和4.61%。

结构域预测显示，BclUBE2蛋白的氨基酸序列第7～139位为泛素结合酶E2家族序列，其中24～38位为WD重复序列，77～92位为泛素结合酶活性位点，88位为高度保守的半胱氨酸残基活性位点。多序列比对发现，E2家族序列在物种进化上高度保守（图3）。将菜心BclUBE2蛋白与其他物种的18条E2蛋白序列进行聚类分析，结果表明菜心BclUBE2蛋白与芸薹属芜菁、油菜、白菜的亲缘关系较近（图4）。

2.3 BclUBE2基因的特异性表达

由图5可知，在低温处理0 h时，菜心BclUBE2基因在根、茎、叶、叶柄中均有表达，但其在不同组织器官中的表达丰度不同。在叶柄中的表达量最低，叶中最高，为叶柄的16.23倍；茎中次高，为叶柄的12.19倍；根中的表达量为叶柄的5.83倍。在低温处理下，BclUBE2基因在不同组织中呈现的变化趋势不同，根中的表达量呈现先降低后升高的变化趋势，且在处理1 h时其表达量最低；在茎、叶、叶柄中均呈现出相反的表达趋势，其中，茎和叶柄处理6 h时的表达量最高，叶片处理1 h时的表达量最高。

3 讨论

本研究获得全长459 bp的菜心BclUBE2基因，该基因编码的蛋白由153个氨基酸组成，含有一个泛素结合酶E2活性位点、一个WD重复序列和一个高度保守的半胱氨酸，属于第1类E2蛋白。多序列比对发现，E2蛋白在物种间高度保守，而进化分析结果显示，菜心BclUBE2蛋白与芸薹属芜菁、油菜、白菜的亲缘关系较近，与萝卜属萝卜的亲缘关系较同属物种甘蓝近，这说明物种间E2蛋白序列较保守。

许多研究表明泛素结合酶E2蛋白在植物器官中普遍存在，如小麦TaE2基因在根、茎、叶和种子中均有表达[12]；巴西橡胶树HbUBC5基因

在树皮、乳胶、叶片和花中均有表达，且在树皮中的表达量最高，乳胶和叶片相对较低[13]；芜菁 BrUBC11基因在花瓣、花蕾、树皮中均有表达，且在花瓣中的表达量最高，花蕾次之[14]；龙葵SorUBC基因在根、茎、叶、花和果实中均有表达，叶片和果实最高，其次为茎、花，根最低[15]；铁皮石斛DoUBC24基因在根、茎、叶和花中的表达量依次为花>茎>种子>根>叶[16]；玉米ZmUBC- 76基因的表达量在根和幼果中最高，穗丝中最 低[17]。本研究结果显示，菜心BclUBE2基因在根、茎、叶和叶柄中也均有表达，其表达量

在叶柄中最低，叶最高，为叶柄的16.23倍；茎次高，为叶柄的12.19倍；根中的表达量为叶柄的5.83倍。这些研究结果说明E2蛋白在植物的不同组织器官间不具备特异性，但在不同组织器官中的表达水平不同，具有表达特异性。

植物在抵御不良环境胁迫的过程中会产生导致植物非正常生长的大量异常蛋白，泛素结合酶E2蛋白能够将活化的泛素分子轉移至靶蛋白上，从而降解异常蛋白，是泛素蛋白酶体途径降解异常蛋白的重要酶类，在清除异常蛋白的过程中具有重大作用[18-21]。本研究发现，在低温胁迫下，菜心BclUBE2基因的表达量在不同器官的变化趋势不同，在根中呈现先降低后升高的变化趋势，且在处理1 h时其表达量最低；在茎、叶、叶柄中均呈现先升高后降低的表达趋势，茎和叶柄处理6 h时的表达量最高，叶片处理1 h时的表达量最高，说明菜心BclUBE2基因在响应低温胁迫中发挥作用。蔡佳文等[15]研究发现，龙葵叶片SorUBC基因在低温胁迫下的表达量均低于对照，呈现出先降低再升高的变化趋势，根部SorUBC基因呈现出相反的变化趋势；花生和香蕉E2基因在低温胁迫下呈上调表达[22-23]；玉米ZmUBC-76基因的表达量在低温胁迫时变化不显著[17]。这些研究结果说明，泛素结合酶E2蛋白在抵御植物低温胁迫时发挥作用，但其表达模式在不同植物间不完全相同，防御低温机理有待进一步研究。

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