超低温对降香种子遗传变异和生理特性的影响

曾琳 顾雅坤 吴怡 魏建和

摘 要 采用单因素随机区组试验方案探究降香种子玻璃化超低温保存最适条件，结合显微切片观察和生理生化特性检测对冷冻后细胞形态和生理生化指标变化进行分析，同时运用形态观察法和相关序列扩增多态性（SRAP）分子标记法对超低温保存后的降香植株遗传稳定性进行检测。结果表明：降香种子玻璃化超低温保存最佳条件为：室温（25 ℃）装载25 min，0 ℃ 玻璃化脱水30 min，40 ℃水浴解冻5 min。对比检测不同冷冻时间的降香种子超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、α-淀粉酶、脱氢酶活性、丙二醛（MDA）含量以及电导率等生理生化指标，无明显差异。显微观察超低温保存前后的降香种胚内部结构，未见明显变化。超低温保存后的降香种子发芽时，出现短暂的生长停滞期，恢复培养后，其表观形态指标与对照植株无明显差异。SRAP技术分析了超低温冷冻前后的降香再生植株，其SRAP带型基本一致，未见明显差异带型。综上表明，超低温保存降香种子是长期稳定、安全可靠的。

关键词 超低温保存；降香；遗传变异；生理生化特性

中图分类号 R931.2 文献标识码 A

Abstract In this study， we used a single factor random block test to optimize cryopreservation procedure of Dalbergia odorifera T. Chen seed by vitrification. The embryo cells of Dalbergia before and after frozen were inspected with microscope by paraffin section method， and the change of physiological and biochemical indexes of seeds before and after frozen were analyzed. In addition， the genetic stability of regenerated plantlets after cryopreservation was tested with sequence—related amplified polymorphism （SRAP） molecular marker method. The results showed that the optimal conditions for Dalbergia odorifera seeds vitrification were 25 min loading condition at room temperature， 30 min dehydration condition at 0 ℃ and 5 min thawing condition at 40 ℃. The was no significant difference in seed physiological and biochemical indexes of different freezing time， and when inspected by microscope before and after cryopreservation， the internal structure of the embryo had no obvious variations. These results suggest that the time of cryopreservation had no significant effect on germplasm preservation of Dalbergia odorifera. When sprouted the seed of Dalbergia odorifera after freeze in liquid nitrogen， there had a short period of stagnation， but the morphological indexes did not vary greatly with those of the control after renewal cultivation. No nucleotide sequence had been altered during cryopreservation， which was indicted by no obvious differences in the banding patterns of DNA fragments between survival material and the control material of the Genomic DNA analyzed by SRAP after cryopreservation. In conclusion， the ultarlow- temperature preservation of Dalbergia odorifera seeds was stable， safe and reliable.

Keywords cryopreservation； Dalbergia odorifera； genetic variation； physiological and biochemical traits

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.008

自1973年Nag等[1]首次成功地将液氮超低温保存技术运用在胡萝卜悬浮培养细胞上以来，超低温保存技术已成功保存了近300种植物材料[2]。大多数的植物材料在超低温环境中，其细胞的新陈代谢活动都会基本停止[3]，从而使细胞的活力和形态发生的能力能够得到稳定保存。液氮冷冻主要是对植物材料存活率和生理生化指标有影响，从理论上讲，经过液氮处理后再生的植物材料不会发生遗传变异[4-6]。但是植物材料在超低温保存过程中，除液氮冷冻外，还涉及预培养、脱水、解冻和恢复培养等，这些过程会给植物材料造成胁迫，增加植物材料的氧化损伤[7]，伤害到植物细胞，从而影响植物材料的再生[8]，并可能对再生植株的遗传稳定性造成一定影响[9-10]。曾继吾等[11]在用透射电镜观察番木瓜（Carica papaya L.）茎尖超低温保存过程中细胞超微结构变化时发现，细胞严重伤害主要发生在液氮冷冻和解冻过程。程志英[12]在观察超低温保存后的菊花（Dendranthema morifolium）茎尖组织结构时发现，PVS2脱水对茎尖造成严重损伤，且液氮冷冻和解冻对茎尖组织细胞造成了不可逆的損伤。所以在对植物材料进行超低温长期储藏前，应对超低温冷冻的几个步骤进行优化。

超低温保存植物材料不止是为了获得高存活率，也是为了得到安全、稳定、保真的再生植株[11]，因此对超低温储藏后的遗传稳定性进行研究是非常有必要的。植物材料表型特征评估可能是检测超低温储藏对植株稳定性影响的最简单的方法[6]。大部分研究表明，超低温保存后的材料在形态学方面没有明显的变化[12]。在对超低温保存后的山药（Dioscorea opposite Thunb.）种质[13]、橡胶（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）愈伤组织[14]、栓皮栎（Quercus variabilis Blume）胚[15]的再生植株中没有发现形态变化，但超低温处理后的杭菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.t. Dulce.）[5]再生苗早期营养生长指标均低于对照。多数研究证明，超低温保存前、后材料的基因组没有发生遗传稳定变异[12]。在对超低温保存前后的五叶草莓（Fragaria pentaphylla Losinsk.）[16]、留兰香

（Mentha spicata Linn.）[17]、人参（Panax ginseng C. A. Mey）[2]、杭菊（Dendranthema morifolium （Ramat.） Tzvel.）[5]、君迁子（Diospyros lotus L.）[18]等植物种质材料进行基因组遗传稳定性检测时，没有发现基因组改变现象；但在冷杉（Abies fabri （Mast.） Craib）、番木瓜等植物种质材料中却发现其基因组改变的现象[9]。

降香（Dalbergia odorifera T. Chen）是我国特有的濒危药用植物，其种子属于顽拗性种子[19]，笔者所在实验室对降香的种子进行了液氮超低温保存，发现适宜含水量的种子超低温保存后均能发芽，但部分芽不能健康地成苗。推测是因为液氮超低温保存过程中的一系列胁迫对降香种子造成了影响。本研究进一步探究降香种子的超低温保存最适条件，结合显微切片观察和生理生化特性检测对超低温冷冻后种子细胞形态和生理生化指标变化进行分析，并运用序列相关扩增多态性（SRAP）分子标记技术从基因组遗传稳定性方面对超低温保存前后的降香植株遗传稳定性进行分析，以期获得稳定、长期保存降香种子的最优方法。

1 材料与方法

1.1 材料

将国家南药基因资源库提供的降香种子置于干燥器皿中，获得含水量为12.5%～13.5%的种子实验材料，密封存于4 ℃冰箱中备用。

1.2 方法

1.2.1 超低温保存方法 对降香种子玻璃化冷冻步骤[19]进行优化：（1）室温（25 ℃）装载处理0～20 min；（2）0 ℃ PVS2玻璃化脱水处理0～ 90 min；（3）液氮冷冻0～7 d；（4）40 ℃水浴解冻30 s～10 min；（5）1.2 mol/L蔗糖的MS培养液+纯净水洗涤；（6）恢复培养：将洗涤后的种子接种到含有0.3 mol/L蔗糖的1/2 MS培养基上，25～28 ℃条件下发芽培养。

1.2.2 遗传稳定性检测

1）形态学观察 定期观察、记录超低温冷冻前后的降香种子发芽率，以及降香再生植株在叶形、叶色、株型和株高上与对照是否存在差异。

2）SRAP分析 采用TIANGEN DNAsecure Plant Kit提取降香再生植株总DNA，–20 ℃保存备用。选用杨云等[20]筛选出的适合降香材料分析的25组SRAP引物，并参照其SRAP分子标记实验程序对降香再生植株进行基因组遗传稳定性分析。

1.2.3 生理生化指标检测 取对照和液氮冷冻30 min、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d的种子各0.5 g，分别提取酶液，并测定以下指标。采用3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定α-淀粉酶活性[21]，氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定种子活力，氮蓝四唑法（NBT法）检测脱氢酶活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性[22]，紫外分光光度法测定过氧化氢酶（CAT）活性，愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性[23]，硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量[24]，参照姜文[25]电导率测定方法测定降香种子电导率。

1.2.4 石蜡切片显微观察 取对照和液氮冷冻30 min、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d的种子其种胚各12颗，进行石蜡切片：FAA固定72 h，梯度酒精各脱水4 h，浸蜡2 h，埋蜡，Leica RM2245半自动轮转式切片机切片，脱蜡，番红、固绿溶液双重染色处理，脱水处理，封胶制成永久切片，Nikon生物显微镜观察。

1.3 数据分析

采用SAS 9.3软件中的ANOVA对实验数据进行多重比较分析。

2 結果与分析

2.1 降香种子玻璃化冷冻程序优化

对降香种子玻璃化冷冻程序中的装载、PVS2脱水以及解冻3个步骤进行了单因子实验处理（图1）。随着装载液处理时间的延长，降香种子发芽率呈上升趋势，但在处理25 min后趋于稳定。实验结果表明，PVS2处理30 min时，降香种子的发芽率最高，处理时间过短或过长都不利于种子的发芽。随着40 ℃水浴解冻时间的延长，降香种子发芽率有所提高，5 min过后其发芽率急剧下降，这可能是因为时间过短，种子和冷冻保护剂还未完全解冻，时间过长，种子吸水膨胀从而损害细胞。

综上所述，降香种子玻璃化超低温保存最适条件为：装载处理25 min，PVS2处理30 min，40 ℃水浴解冻5 min。

2.2 液氮冷冻时间对降香种子存活率和理化性质的影响

2.2.1 液氮冷冻时间对降香种子生活力的影响 随着液氮冷冻时间的延长，降香种子生活力呈下降趋势，但在冷冻3 d时出现上升，这可能是在液氮的刺激下，激发了种子细胞的防卫反应。降香种子生活力虽下降了，但仍在80%以上（图2）。

2.2.2 液氮冷冻时间对降香种子生理生化特性的影响 如图3所示，随着冷冻时间的增加，降香种子生理生化指标值均有所变化。其中，丙二醛含量随着冷冻时间的延长，其值上下浮动，但变化不大，这说明液氮冷冻对降香种子细胞膜脂过

氧化作用影响不大。相对电导率在冷冻3 d和5 d时其值上下波动，但波动幅度不大，最终与对照相差无几，说明液氮冷冻未对降香种子膜质造成损伤。α-淀粉酶活性的变化呈下降、上升交替现象，最终趋于稳定并高于对照，表明液氮冷冻促进了可溶性糖的积累，提高了细胞的抗逆性。脱氢酶活性在冷冻1～2 d时急剧下降，但冷冻3 d后又上升至稳定不变，说明液氮冷冻改变了种子催化氧化还原酶的能力。过氧化氢酶活性在冷冻1 d时开始下降，说明种子活力下降了；在冷冻3 d时出现小幅上升，这可能是细胞出现的短暂性保卫反应；这结果与图2结果一致。过氧化物酶活性在冷冻1 d时下降幅度较大，随后又开始上升并趋于平稳，最终高于对照，这可能是液氮冷冻影响了活性氧清除系统的能力，从而导致细胞内活性氧、自由基的量变化不均。超氧化物歧化酶活性随着冷冻时间的延长，缓慢上升，这表明在液氮冷冻刺激下种子清除自由基的能力增强了。

2.2.3 液氮冷冻时间对降香种胚组织的影响 对不同冷冻时间处理的降香种胚进行石蜡切片显微观察，结果如图4所示，对照组种胚细胞排布紧密、且细胞内含物分布均匀；冷冻后的种胚细胞均出现轻微的质壁分离，其中液氮冷冻30 min和3 d的种胚细胞质壁分离最明显，冷冻3、5、7 d的种胚出现少量空洞区域，而冷冻1、2 d的种胚细胞排布均匀紧密。总体而言，不同冷冻时间处理的种胚细胞结构没有出现较大的差异，这说明冷冻时间的长短对降香种胚细胞结构无显著影响。

2.3 超低温保存后再生植株遗传稳定性检测分析

2.3.1 形态特征比较 对照种子接入培养基培养2～3 d即可发芽，冷冻处理1 d的种子需3～5 d发芽。出芽后200 d，再生植株与对照植株在叶形、叶色、株型、株高上未见明显差别（图5）。

2.3.2 SRAP技术检测基因组稳定性 应用SRAP技术对超低温冷冻1 d后和对照组的降香种苗进行检测分析，25组引物均能扩增出清晰的条带，共扩增出可统计条带542条。每组引物对2个处理组样品扩增的多态性位置基本相同，部分条带如图5所示（从左至右其引物分别为：M8E7、M8E16、M9E11[20]），说明对照与超低温冷冻后的降香种苗之间基因组序列保持一致，未发生遗传变异。

3 讨论

本研究進一步探究了降香种子玻璃化超低温保存最适条件。研究过程中发现：装载时间越长降香种子活力越高，但在25 min后趋于稳定，这是由于装载液进入种子细胞内，增加了细胞内的渗透压同时也降低了冰点，起到了保护种子的作用；随着PVS2处理时间的延长，降香种子发芽率出现先上升后下降现象，这可能是由于处理时间过短导致的玻璃化不完全，从而导致种子在冻存过程中受到损伤，当处理时间过长时，冷冻保护剂二甲亚砜对种子的毒害作用导致了种子发芽率的下降。同时发现，超低温冷冻时间对超低温保存降香种子的存活率并无显著影响，这与Mony等[26]、朱文涛等[18]、郭强梨等[19]、李俊慧等[27]的研究相符。

植物组织在受到外界胁迫时会产生大量自由基，使得膜脂过氧化生成MDA，MDA含量的增加导致细胞中离子大量外渗，从而导致植物组织相对电导率增加[28-29]。然而，植物组织中也有防御系统，SOD、POD、CAT和脱氢酶是植物组织重要的保护酶，可以减少或清除活性氧自由基，防止自由基对植物组织的毒害[30]。SOD可消除氧自由基产生过氧化氢，POD和CAT可分解过氧化氢为水，这正是植物体本身对外界胁迫在生理生化方面所做出的积极反应[29]。本实验结果显示，超低温保存后的降香种子MDA含量和相对电导率略有下降，而SOD、POD、CAT和脱氢酶活性均略高于冷冻前，即超低温冷冻后降香种子内膜过氧化能力稍有提高。这是由于液氮超低温冷冻过程给植物组织制造了一个低温胁迫环境，在这个环境中，植物组织体内的SOD、POD酶活性会增强，以清除活性氧自由基，从而降低植物体内的活性氧自由基和MDA含量，导致相对电导率降低[29， 31]。

对植物种质资源保存来说，不仅要保证物种的延续，而且也要尽可能确保其再生植株的遗传稳定性[32]。超低温保存可以避免田间保存和继代培养过程中产生的遗传变异和突变的风险，实现植物种质资源长期、安全、稳定保存[33]。本研究中，降香种子生活力随着液氮冷冻时间的延长，并未出现大幅度降低的现象，这保证了降香种质的延续。在对降香再生植株表观形态观察时发现，超低温冷冻后的降香种子与对照相比，恢复培养时出现2～3 d的停滞期，可能是由于种子在超低温保存过程中其生理状态受到影响造成的。但培养一段时间后，冷冻处理组与对照组的生长状态表现一致，这保证了降香种质再生植株的形态稳定，与木茼蒿[34]、人参[2]、菊花[35]种质资源超低温保存后的结果一致。采用SRAP分子标记技术对超低温保存后的降香再生植株进行基因组遗传稳定性检测时，未检测到遗传变异，这确保了降香种质的遗传稳定性。综上所述，降香种子液氮超低温保存技术是安全可靠的。

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