培养条件及杀菌剂对玉米穗腐病菌可可毛色二孢生长的影响

刘树森　胡清玉　杨扬　李坡　马红霞　石洁

摘 要 可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）穗腐病是近年来发生在玉米上的一种新病害。本文研究了不同培养基、温度、pH、碳源和氮源对该病原菌生长的影响，并评价了8种杀菌剂对该病原菌的抑制效果。结果表明，25 ℃培养1 d后，可可毛色二孢在PDA和MLPA两种培养基上生长速度最快，菌落直径分别为49.88 mm和48.13 mm，显著大于其他处理（p<0.05）；最适合该病原菌生长的温度为30 ℃，培养1 d后菌落直径为61.88 mm，显著大于其他温度处理（p<0.05）；在55 ℃处理10 min后的菌落不能继续生长；最适合该病原菌生长的pH为6，25 ℃培養1 d后菌落直径可达到75.00 mm，显著大于其他处理（p<0.05）；淀粉和硝酸钠分别为可可毛色二孢生长所需的最佳碳源和氮源，在上述两种培养基上培养1 d的菌落直径分别为58.13 mm和37.13 mm，均显著大于其他处理（p<0.05）。咯菌腈、甲基硫菌灵和异菌脲对可可毛色二孢有较好的抑制效果，EC50均小于1 mg/L。本研究结果为深入了解可可毛色二孢玉米穗腐病的发生规律和制定有效防治策略提供依据。

关键词 玉米穗腐病；可可毛色二孢；培养条件；杀菌剂；抑制效果

中图分类号 S435.131 文献标识码 A

Abstract Maize ear rot caused by Lasiodiplodia theobromae is a new disease reported in recent years. In this study， the effects of different media， temperatures， pH value， carbon and nitrogen sources on the growth of L. theobromae were investigated， and the inhibitory activity of 8 fungicides to this pathogen was evaluated. After incubation at 25 ℃ for 1 day， the best growth of L. theobromae was recorded at PDA and MLPA media with the colony diameters of 49.88 mm and 48.13 mm， respectively， which were significant greater than those of the other treatments （p<0.05）. The optimal temperature for L. theobromae growth was 30 ℃ with the colony diameter of 61.88 mm， which was greater than that of the other treatments （p<0.05）， and no mycelial growth was noted at 55 ℃. pH 6 was best for L. theobromae growth at 25 ℃ for 1 day with the colony diameter of 75.00 mm， and there was a significant difference between this treatment and the others （p<0.05）. On the media amended with starch and sodium nitrate， the colony diameter was 58.13 mm and 37.13 mm， respectively， which were significantly higher than that of the other treatments （p<0.05）. The EC50 values of fludioxonil， thiophanate-methyl and iprodione to L. theobromae were less than 1 mg/L， indicating that these three fungicides performed well on inhibiting the growth of this pathogen. The results would provide a basis for further understanding the occurrence regularity of maize ear rot caused by L. theobromae and making effective management strategy.

Keywords maize ear rot； Lasiodiplodia theobromae； culture condition； fungicide； inhibition activity

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.021

玉米穗腐病（maize ear rot）发生在玉米生长后期，田间发病率通常为5%～10%，发病严重的年份不低于50%，造成的损失达30%～40%[1]。玉米穗腐病病原菌不仅会造成籽粒霉变或腐烂，导致产量和品质下降，所产毒素也会给食品与饲料生产造成极大安全隐患[2-3]。可可毛色二孢（Lasio?diplodia theobromae）引起的玉米穗腐病最初发现于海南省乐东县玉米南繁基地[4]，并于次年在三亚市崖城区南滨农场再次被发现。发病果穗籽粒下半部腐烂，籽粒覆盖下的穗轴呈炭黑色，有的果穗整个穗轴尤其是轴心呈灰黑色干腐，症状不易被发现；轻度感染的籽粒顶端表皮呈现白色或放射性白色条纹，重度感染时籽粒发黑霉变，部分籽粒种皮开裂，胚乳呈黑色；湿度大时，在病部表面和籽粒间隙可见灰黑色霉层。该病害连续在不同地点发生，且对果穗的品质造成严重影响，有可能成为玉米生产上的潜在威胁。

可可毛色二孢是一种重要植物病原真菌，主要分布在热带、亚热带和温带气候区，其寄主多达500余种[5]。据报道，该病原菌可引起果树和果实病害，如葡萄溃疡病[5]、桃和杧果流胶病[6-8]、桑树根腐病[9]、龙眼果实焦腐病[10]、沙田柚果腐病[11]、莲雾黑腐病[12]、香蕉冠腐病[13-14]等；也可引起经济树种或药用植物病害，如肉桂枝枯病[15]、桉树梢枯病[16]、大叶伞干腐病[17]以及铁皮石斛茎腐病[18]等；此外，它还是高良姜叶枯病[19]、甘薯爪哇黑腐病[20]和花生颈腐病[21]的主要病原菌。有研究表明，广西桉树枝枯病菌株最适生长温度为30 ℃，最适生长pH为5.5，对蔗糖和硝酸钠的利用率最高[22]；广东梅州沙田柚果腐病菌株最适生长温度为25～30 ℃，最适碳、氮源分别为果糖和甘氨酸[23]；而福建漳州莲雾黑腐病菌株的最适生长温度为25 ℃，最适生长pH为8.0，最佳碳源为甘露醇[12]。由此可见，可可毛色二孢不同菌株生物学特性存在一定差异。目前，对可可毛色二孢的防治依然以使用化学药剂为主。Syed等[24]认为低浓度的多菌灵（carbendazim）和噻菌灵（thiabendazole）即可有效抑制可可毛色二孢生长；da Silva Pereira等[25]的研究结果表明，苯菌灵（benomyl）和噻菌灵对可可毛色二孢敏感菌株的平均EC50分别为0.002～0.13 μg/mL和0.36～ 1.27 μg/mL，咪鲜胺（prochloraz）和戊唑醇（tebuconazole）的平均EC50分别为0.04～1.75 μg/mL和0.14～4.05 μg/mL；Rehman等[26]和Khanzada等[27]认为甲基硫菌灵（thiophanate- methyl）、苯醚甲环唑（difenoconazole）和乙霉威（diethofencarb）对可可毛色二孢同样有较好的抑制效果，而且随着浓度提高，效果也会增强。

海南省是我国重要的南繁育种基地，其与内陆地区频繁的种子交流活动为病原菌的传播提供了便利条件。虽然，可可毛色二孢穗腐病仅在海南省部分地区自然发病，但在保定地区人工接菌的果穗上表现出与自然发病果穗一致的症状，说明其病原菌有向内陆传播扩散的风险。因此，本研究针对该病原菌的培养特性做了初步研究，旨在明确适合该病原菌生长的培养基、温度、pH和碳、氮源等条件，同时评价了8种杀菌剂对该病原菌的抑制作用，为今后该病害的发生规律研究及制定、优化防控策略提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株分离自海南省乐东县玉米南繁基地的发病玉米果穗，经纯化后鉴定为可可毛色二孢[4]，并保存在河北省农林科学院植物保护研究所。

1.1.2 供试菌饼 26 ℃条件下，将纯化后的菌株在PDA平板培养基上培养2 d，然后用直径5 mm的打孔器从菌落边缘打取菌饼待用。

1.1.3 供试药剂 99%吡唑醚菌酯（pyraclo?strobin）原药、98.7%异菌脲（iprodione）原药、98.1%嘧菌酯（azoxystrobin）原药、97.56%甲基硫菌灵原药、98.00%戊唑醇原药、96.00%苯醚甲环唑原药、97.00%咯菌腈（fludioxonil）原药和97.00%咪鲜胺原药。将以上原药用丙酮溶解，并配制成10 000 mg/L的母液，贮藏于4 ℃冰箱中备用，使用时用无菌水稀释至使用浓度。

1.2 方法

1.2.1 不同培养基对可可毛色二孢生长的影响

选用以下9种培养基。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉17 g，蒸馏水1 L；马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂粉17 g，蒸馏水1 L；玉米粉琼脂培养基（CMA）：玉米粉30 g，琼脂粉17 g，蒸馏水1 L；玉米浸汁培养基（CTA）：玉米茎秆200 g，琼脂粉17 g，蒸馏水1 L；玉米叶煎汁平板培养基（MLPA）：鲜玉米嫩叶200 g，马铃薯20 g，番茄20 g，胡萝卜20 g，碳酸钙 3 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 L；玉米叶粉碳酸钙琼脂培养基（MLPCA）：玉米叶粉15 g，碳酸钙 1.5 g，琼脂粉12 g，蒸馏水1 L；燕麦片琼脂培养基（OA）：燕麦片30 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 L；察氏培养基（Czapek）：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 L；水琼脂培养基（WA）：琼脂粉15 g，蒸馏水1 L。

将制备好的菌饼分别转接至上述培养基，每皿放置1片，每处理重复4次。25 ℃恒温箱中黑暗培养1 d后，采用十字交叉法测量菌落直径（下同），比较病原菌在不同培养基上的生长状况。

1.2.2 不同培养温度对可可毛色二孢生长的影响

将制备好的菌饼转接至PDA平板培养基中央，于5、10、15、20、25、30、35 ℃共7个温度条件下恒温培养，每皿放置1片，每处理重复4次。黑暗培养1 d后测量菌落直径，比较不同温度下病原菌的生长状况。采用试管水浴法，测定病原菌的致死温度。将5块菌饼置于装有无菌水试管中，利用水浴锅对试管进行加热。以2.5 ℃间隔设置梯度，在40～60 ℃设置8个梯度，每梯度加热处理10 min，取出迅速冷却并将菌饼移植至PDA平板培养基中央，每处理重复4次，25 ℃恒温培养并连续观察5 d。

1.2.3 不同pH对可可毛色二孢生长的影响

用1.0 mol/L的鹽酸或氢氧化钠溶液调节制成pH分别为3、4、5、6、7、8、9、10和11的PDA平板培养基，然后将制备好的菌饼移植到培养基上，每皿放置1片，每处理重复4次。25 ℃下培养1 d后测量菌落直径，比较不同pH条件下病菌的生长状况。

1.2.4 不同碳、氮源对可可毛色二孢生长的影响

以察氏培养基（Czapek）作为基础培养基，分别用葡糖糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、淀粉等量置换其中的蔗糖制成含不同碳源的培养基；用脯氨酸、尿素、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵等量置换其中的硝酸钠制成含不同氮源的培养基。将菌饼移植入上述培养基，25 ℃培养1 d后测量菌落直径以评价病菌在不同碳、氮源培养基上的生长状况，每处理重复4次。

1.2.5 杀菌剂对可可毛色二孢生长的抑制作用

采用生长速率法测定8种杀菌剂对病原菌生长的抑制作用。将菌饼接种到含有不同药剂浓度的PDA平板培养基上（吡唑醚菌酯：20 000、10 000、1 000、100、10 mg/L；异菌脲：100、10、1、0.2、0.1 mg/L；嘧菌酯：100、20、10、2和1 mg/L；甲基硫菌灵：100、10、1、0.1、0.01 mg/L；戊唑醇：1 000、100、10、2、1 mg/L；苯醚甲环唑：1 000、100、10、1、0.1 mg/L；咯菌腈：10、1、0.2、0.1、0.02 mg/L；咪鲜胺：1 000、100、10、1、0.1 mg/L；以2%的丙酮作为对照），每个浓度处理重复4次。25 ℃恒温培养箱中培养，对照长满平板后测量各处理的菌落直径，确定各种药剂对病原菌的抑制率。

通过抑制几率值和药剂浓度对数值之间的线性回归分析，求出各药剂对菌株的有效抑制中浓度（EC50值）[28-29]。

生长抑制率（%）=

1.3 数据分析

所有数据均由Microsoft Excel 2003与SPSS 16.0软件进行统计分析，方差分析和差异显著性检验采用Duncan法。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对可可毛色二孢生长的影响

由图1可知，25 ℃培养1 d后，可可毛色二孢在供试的9种培养基上均可生长，但生长速度有一定差异。病原菌在WA上的生长速度最慢，菌落直徑仅为18.25 mm，相较于在其他8种培养基上的菌落更为稀薄；在PDA和MLPA两种培养基上的生长速度最快，菌落直径分别达到49.88 mm和48.13 mm，二者之间差异不显著（p>0.05）；在PSA、OA、MLPCA、CMA、CTA和Czapek等培养基上形成的菌落直径依次递减，均显著小于在PDA和MLPA培养基上的菌落直径（p<0.05）。

2.2 不同温度对可可毛色二孢生长的影响

可可毛色二孢在不同温度条件下的生长速度不同（图2）。在所有供试的温度处理中，5 ℃时，病原菌不能生长；在10～15 ℃范围内，生长速度缓慢；在20～30 ℃范围内，生长速度较快，呈直线上升趋势；在35 ℃时，生长速度出现下降趋势。最适合可可毛色二孢生长的温度为30 ℃，菌落直径可以达到61.88 mm，显著大于在其他温度下的菌落直径（p<0.05）。致死温度实验结果表明，52.5 ℃处理10 min后，菌落生长缓慢且不能正常变为灰褐色；55 ℃处理10 min后，菌落即不能生长，因此该温度为病原菌的致死温度。

2.3 不同pH对可可毛色二孢生长的影响

结果表明，可可毛色二孢在pH 3～11的范围内均可生长。当pH在3～6范围内时，菌落生长速度呈直线增长趋势；当pH在6～11范围内时，菌落生长速度则呈现缓慢下降趋势（图3）。pH为6时，生长速度最快，菌落直径达75.00 mm，显著大于其他pH时的菌落直径（p<0.05）。总体来看，弱酸至碱性的环境更利于该病原菌的生长。

2.4 不同碳、氮源对可可毛色二孢生长的影响

可可毛色二孢在所有供试的碳源和氮源培养基上均能生长，但菌落生长速度有所差异（表1）。在供试的6种碳源中，淀粉最有利于可可毛色二孢的生长，25 ℃培养1 d后菌落直径达58.13 mm，显著高于其他处理（p<0.05）；其次为蔗糖，菌落直径为52.50 mm，显著高于除淀粉之外的处理（p<0.05）；而在其余4种碳源培养基上，可可毛色二孢的生长速度并没有显著性差异（p>0.05）。相对于碳源，可可毛色二孢在供试氮源培养基上的生长速度差异较大。25 ℃培养1 d后，该病原菌在以硝酸钠为氮源的培养基上生长最快，菌落直径达37.13 mm，显著高于其他处理（p<0.05）；在以脯氨酸为氮源的培养基上次之，菌落直径为32.00 mm；尿素最差，菌落直径仅为9.25 mm。但随着对该病原菌的继续培养，在硝酸钠、脯氨酸、尿素培养基上菌落都能长满培养皿，且菌丝茂密，而氯化铵、硝酸铵、硫酸铵培养基上的菌落生长受限，且菌丝稀疏，颜色变浅，因此，这3种氮源不适合用作该病原菌的培养。

2.5 杀菌剂对可可毛色二孢的抑制效果

8种杀菌剂对可可毛色二孢的毒力存在一定差异（表2），其中吡唑醚菌酯对该病原菌的抑制活性最弱，EC50为2 911.17 mg/L。咯菌腈对可可毛色二孢的抑制活性最强，EC50为0.09 mg/L，为吡唑醚菌酯的32 346.33倍；其次为甲基硫菌灵和异菌脲，二者对该病原菌的EC50分别为0.23 mg/L和0.88 mg/L，分别是吡唑醚菌酯的12 657.26倍和3 308.15倍；苯醚甲环唑、咪鲜胺和嘧菌酯对该病原菌也有较好的抑制作用，EC50分别为1.32 mg/L、2.29 mg/L和14.84 mg/L，分别是吡唑醚菌酯的2 205.43、1 271.25和196.17倍。

3 讨论

本文研究了不同培养条件对玉米穗腐病菌可可毛色二孢生长的影响，并评价了8种杀菌剂对该病原菌的抑制效果，为深入了解病害发生规律和制定有效防治策略奠定基础。研究结果表明，可可毛色二孢在供试的9种培养基上均能生长，但在PDA和MLPA两种培养基上的生长速度最快；适合可可毛色二孢生长的温度范围为25～ 35 ℃，但30 ℃时菌落生长最快，与廖旺姣等[22]、董章勇等[23]、张居念等[30]、史国英等[31]、薛振南等[32]和Saha等[33]的研究结果一致，说明该病原菌嗜高温，若作物敏感期温度较高则有可能增加其侵染机会。黄淮海区夏玉米吐丝期正值7月底、8月初，气温在30 ℃左右，可可毛色二孢极易通过花丝通道侵染导致玉米穗腐病。上述几项研究表明，可可毛色二孢生长的最佳pH通常在5～8。本研究所用菌株在pH 6时的菌落生长最快，且弱酸至碱性环境相较于酸性环境更有利于其生长；桉树、沙田柚和毛葡萄等寄主上分离的菌株分别对蔗糖、果糖和葡萄糖[22-23， 31]的利用率最高，但最适合本研究所用菌株生长的碳源为淀粉，这可能与玉米籽粒胚乳的主要组成是淀粉有关[34]。

杀菌剂毒力测定结果表明，除吡唑醚菌酯外，其他7种供试药剂对可可毛色二孢均有一定的抑制作用。咯菌腈的抑菌效果最好，该药剂属于苯基吡咯类保护性杀菌剂，由于其较低的毒性和风险性，常被用于柑橘果实的采后处理，预防由可可毛色二孢引起的蒂腐病[35]。甲基硫菌灵和异菌脲的抑菌效果次之。甲基硫菌灵属于苯并咪唑类，直接作用于β-微管蛋白基因，阻断有丝分裂进而影响真菌发育。但此类药剂作用靶标单一，病原菌极易产生抗药性，有研究表明可可毛色二孢对甲基硫菌灵、苯菌灵和噻菌灵3种苯并咪唑类药剂敏感度呈正相关性[36-37]。异菌脲属于二甲酰亚胺类杀菌剂，通过影响蛋白激酶的活性抑制真菌菌丝生长，此类药剂常用作水果保鲜剂，对于甲基硫菌灵、多菌灵等药剂的抗性菌株有一定效果[38]，但也有研究认为该药剂对可可毛色二孢的抑菌效果并不理想[39]。本研究结果表明，三唑类杀菌剂苯醚甲环唑和戊唑醇以及咪唑类杀菌剂咪鲜胺对可可毛色二孢也有一定的抑制效果，与唐利华等[40]、张云霞等[17]、da Silva Pereira等[25]、Rehman等[26]和Khanzada等[27]的研究结果基本一致。综上所述，咯菌腈对可可毛色二孢的抑菌效果最好，该药剂安全性较高，且普遍用于水果采后的病害防治，可以作为预防玉米可可毛色二孢穗腐病的首选药剂；甲基硫菌灵和异菌脲也表现出较好的抑菌效果，但可可毛色二孢易对苯并咪唑类药剂产生交互抗性，若将甲基硫菌灵与咯菌腈、异菌脲以及其他三唑类药剂交替使用或复配，可避免或延缓抗药性的产生或加剧。

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