五指山水满茶的茶多酚、总黄酮含量与抗氧化活性研究

苏凡 杨小波 李东海 刘子金 岑举人

摘 要 为了进一步深入了解五指山水满茶的营养价值和保健功效，本研究对五指山水满茶及其他6种茶（普洱茶、白毛茶、白沙绿茶、西湖龙井、兰贵人和碧螺春）的提取物的抗氧化活性及其茶多酚、总黄酮含量进行了比较分析。结果表明：7种茶的75%乙醇提取液的抗氧化效果最好，且提取液的抗氧化活性与样品浓度成正比关系，整体热稳定性比较好。在7种茶中，水满茶清除ABTS自由基、超氧自由基和羟自由基的能力最强，且在测试浓度范围内清除能力均与样品浓度表現出量效关系，但水满茶清除DPPH自由基的能力最弱；还原能力是白毛茶最强，其次是白沙绿茶和水满茶。7种茶的总黄酮和茶多酚含量分别在3.06%～5.4%和14.6%～18.1%之间，其中，水满茶的茶多酚含量最低，但总黄酮含量却最高。因此，五指山水满茶具有较强的抗氧化活性，较高的总黄酮含量，具有较高的营养价值和保健功效。

关键词 五指山水满茶；抗氧化；总黄酮；茶多酚

中图分类号 TS272 文献标识码 A

Abstract For further understanding the nutritional value and health-promoting function of the Hainan Wuzhishan-Shuiman tea， this research compared the antioxidant activities， the contents of tea polyphenols and total flavonoids of Wuzhishan-Shuiman tea with six other teas. Our results showed that 75% ethanol extracts of the seven teas had the highest antioxidant activity. The antioxidant activities of the extracts were proportional to the sample concentrations for the seven kinds of teas，with generally good thermal stabilities. Wuzhishan-Shuiman tea had the best ABTS+·， superoxide and hydroxyl radicals scavenging capacity， with a dosedependent manner in the sample concentration range of the test， but had weaker DPPH· radicals scavenging capacity. Baimao tea had the highest antioxidant activity， followed by Baisha tea and Wuzhishan-Shuiman tea.The content of total flavonoids and tea polyphenols was respectively 3.06%-5.4% and 14.6%-18.1% for the seven teas， Wuzhishan-Shuiman tea was also detected to contain the lowest tea polyphenols， while have the highesttotal flavonoids. In conclusion， Wuzhishan-Shuiman tea has good antioxidant activity and high content of total flavonoids， which is worthy of further exploration and development.

Key words Wuzhishan-Shuiman tea； antioxidant activity； total flavonoids； tea polyphenols

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.010

茶是深受当今世界人民喜爱的饮品，不仅因其具有独特风味，还因为茶对人体具有营养价值和保健功效。研究表明，茶叶中含有对人体有益的茶多酚和黄酮类物质，其中黄酮类化合物在抗氧化、抑制脂质过氧化反应、预防心血管疾病、防癌、抗癌方面等效果明显[1-2]，茶多酚氧化聚合形成茶黄素等物质，对心血管疾病的预防与治疗也具有明显的作用[3]。

海南野生茶为山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）植物，分类学家认为与普洱茶（C. sinensis var. assamica）同是茶的变种[4-5]，五指山地区的野生茶主要分布于热带低地雨林和山地雨林过渡区域的森林群落中，约在800-1000 m的中海拔地段[6]。五指山水满茶是采集分布在海南五指山地区的野生茶的嫩叶制作而成，因主要由海南五指山水满乡水满村村民生产，故称五指山水满茶（以下简称水满茶）。根据加工工艺的不同，可将水满茶分为绿茶、红茶。《琼台志·土产》中有明确记载，水满茶有近千年的发展历史，在清代曾被列为朝廷贡品[7-9]。水满茶具有促进人体新陈代谢、提神醒脑、消除疲劳，预防消化不良和消热解毒等多种功效[10]，已获得国家农业部地理标志登记，成为海南农产品新的品牌。五指山市政府安排专项资金，在保护好生态的前提条件下，大力发展水满茶产业[9]。目前，有关水满茶的抗氧化能力、茶多酚和黄酮含量等相关指标的研究未见报道。本文研究了水满茶的抗氧化活性及茶多酚、总黄酮的含量，并与其他6种茶（普洱茶、白毛茶、白沙绿茶、西湖龙井、兰贵人和碧螺春）进行比较分析，对水满茶进行科学的营养价值和保健功效评价，为水满茶产业的健康发展提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 随机在市场上购买五指山水满香红茶（海南省五指山椰仙生物科技有限公司）、云南普洱（云南勐海老大为茶叶有限公司）、西湖龙井（杭州梅家坞梅源茶叶有限公司）、白毛茶（广东省韶关市仁化红山）、兰贵人（海口海茗贸易有限公司）、白沙绿茶（海南农垦白沙茶业股份公司）和碧螺春（江苏溧阳天福观光茶园有限公司）等成品茶叶（均是春天采摘的一芽两叶茶叶）作为試验材料。

1.1.2 试剂 正己烷、无水乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、水杨酸、30%双氧水、盐酸、磷酸、硫酸锂、溴、VC、氯化铁、硫酸亚铁、氯化铝、乙酸钠、铁氰化钾（广州化学试剂厂）；芦丁、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、NBT（上海麦克林生物有限公司）；DPPH（Sigma公司）；ABTS（东京化成工业株式会社）；没食子酸（北京百灵威科技有限公司）；L-甲硫氨酸、核黄素（美国Amresco公司）；蒸馏水。以上化学试剂均为分析纯或以上。

1.1.3 仪器 梅特勒-托利多PL303电子分析天平[（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；SG5200HB-三频超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；UV-2100型紫外可见分光光度计[（尤尼柯（上海）仪器有限公司]；DK-S24电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；HY-08小型高速粉碎机（北京环亚天元机械有限公司）；Avanti J-25系列高效离心机（美国Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 茶叶提取物的制备 将7种茶叶分别用高速粉碎机粉碎。称取每种茶叶粉末样品各5份、每份2.0 g，置于具塞锥形瓶中，再加入一种提取剂（三氯甲烷，乙酸乙酯，正己烷，75%乙醇，无水乙醇）20 mL，称定重量后浸泡24 h，用超声处理（功率100 W，频率40 kHz，无温度控制）1 h，待自然冷却至常温后再称定重量，用对应的提取剂补足损失的重量。摇匀后过滤，滤液在4 000 r/min条件下离心30 min，取上清液备用。

1.2.2 清除DPPH自由基（DPPH·）的能力 参照周靖等[11]的方法测定茶叶提取液的DPPH自由基清除率。

1.2.3 清除ABTS自由基（ABTS+·）的能力 参照高文霞[12] 的方法测定茶叶提取液的ABTS自由基清除率。

1.2.4 清除羟自由基（·OH）的能力 参照马艳芝[13]研究中测定羟自由基（·OH） 清除率的方法。取1 mL样品液，加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，200 μL 9 mmol/L H2O2和800 μL的水。37 ℃水浴加热30 min，在510 nm处测定吸光值。设置一个对照管和样底管，对照管中用水代替茶叶提取液，样底管中用水代替H2O2。以VC作为阳性对照。

1.2.5 清除超氧自由基（O2-·）的能力 采用光照核黄素—氮蓝四唑（NBT）法测定茶叶提取液的超氧阴离子自由基清除率[14]。

1.2.6 还原能力的测定 参照刘子金等[15]的方法测定茶叶提取液的还原能力。

1.2.7 总体抗氧化活性的热稳定性检测 取7种茶叶的提取液（浓度8 mg/ml）各1 mL，分别在40～100 ℃下孵育30 min，然后按照1.2.2所述DPPH法测定样品的抗氧化活性；将提取液在沸水中分别孵育不同时间（0～150 min），再采用DPPH法测定其抗氧化活性。

1.2.8 总多酚和总黄酮含量的测定 总黄酮含量采用三氯化铝比色法[16] 测定，略有改动。以芦丁（0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL）为标准物，绘制标准曲线。采用紫外—可见分光光度法，在420 nm波长处测定吸光度。

总多酚含量采用福林酚（Folin-Ciocalteu）比色法[17-18]测定，略有改动。以没食子酸（0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/mL）为标准物，绘制标准曲线。采用紫外—可见分光光度法，在 760 nm 的波长处测定吸光度。

1.3 数据分析

所有试验重复3次， 采用Office2010软件进行数据初步处理， Graphpad Prism5.0软件作图，SPSS 22.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 7种茶叶提取液的抗氧化活性分析

2.1.1 清除DPPH和ABTS自由基的能力 通过DPPH法和ABTS法对7种茶叶不同溶剂提取液的抗氧化活性进行测定。结果表明，在相同浓度（8 mg/mL）下，同一种茶叶的不同溶剂提取液清除自由基的能力不同；在5种提取剂中，75%乙醇提取液清除两种自由基的能力最好，而无水乙醇次之（图1）。每种茶叶的75%乙醇提取液对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率均与提取物浓度呈正量效关系，即随着质量浓度增加，对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率也增大（图2）。

由表1可知，7种茶叶的75%乙醇提取液对 DPPH自由基和ABTS自由基的半抑制浓度有所不同，但均具有较强的清除效果。其中，水满茶对ABTS自由基的清除效果最佳， IC50低至 0.439 mg/mL，而兰贵人的IC50高达1.278 mg/mL，两者之间差异极显著（p<0.01），后者的IC50值约是前者的 2.9 倍；白沙绿茶对DPPH自由基的清除效果最佳，其IC50低至0.582 mg/mL，而水满茶对DPPH自由基的清除效果最差，IC50为1.523 mg/m L，两者之间差异极显著（p<0.01），后者的IC50值约是前者的 2.6倍。

2.1.2 清除羟自由基（·OH）和超氧自由基（O2-·）的能力分析 在浓度为0.5～4mg/mL范围内，7种茶叶75%乙醇提取液清除羟自由基的能力随着浓度的增加而增加，即清除能力与浓度成正比（图3）。在初始浓度0.5 mg/mL时，水满茶提取液的清除率已经高达67.0%，明显高于其他6种茶叶的清除率，略低于对照品VC（72.0%）；在浓度为1.5 mg/mL时，水满茶提取液的羟自由基清除率（78.2%）已超过VC（74.9%）。

由圖4可看出，在浓度小于或等于2.4 mg/ml时，水满茶提取液清除超氧自由基（O2-·）的能力弱于兰贵人、碧螺春、白沙绿茶、白毛茶和普洱茶，仅高于龙井茶；但当浓度大于2.4 mg/mL时，水满茶提取液清除超氧自由基（O2-·）能力迅速升高，到4.8 mg/mL时高于其他6种茶。

2.1.3 还原能力分析 由图5可知，以没食子酸作为对照，7种茶叶的还原能力与提取液浓度成正量效关系。在浓度为0.06～0.48 mg/mL，水满茶提取液的还原能力高于碧螺春、兰贵人、龙井、普洱。与白毛茶相比，在提取液浓度为0.24～0.36 mg/mL时，水满茶的还原能力大于白毛茶，但随着提取液浓度的增加，水满茶的还原能力又低于白毛茶。水满茶与白沙绿茶的还原能力较为接近，在提取液浓度为0.06～0.18 mg/mL以及0.48 mg/ml时，水满茶的还原能力略低于白沙绿茶；但当提取液浓度为0.24～0.42 mg/mL时，水满茶的还原能力则略高于白沙绿茶

2.1.4 热稳定性检测分析 7种茶叶的75%乙醇提取液在不同温度下其抗氧化活性变化不大。在40～100 ℃之间，水满茶、云南普洱、西湖龙井、白沙绿茶碧螺春的抗氧化活性没有太大变化；在70～90 ℃之间，兰贵人、白毛茶的抗氧化活性有轻微的上升趋势（图6）。通过研究沸水孵育对7种茶叶提取液抗氧化活性的影响（图7）可知，在100 ℃条件下，时间的延长对这7种茶叶75%乙醇提取液抗氧化性的影响不显著。

2.2 茶多酚与总黄酮含量的测定分析

7种茶叶中的茶多酚和总黄酮含量具体情况见表2。其中，水满茶的总黄酮含量最高（5.43%），是普洱茶（3.06%）的1.77倍；白沙绿茶、白毛茶、龙井茶这三者的黄酮含量差异不显著。从7种茶叶的茶多酚含量来看，普洱茶的含量最高（18.1%），而水满茶的含量最低（14.6%），普洱茶的茶多酚含量是水满茶的1.24倍。

3 讨论

海南五指山地区海拔相对较高，属热带山区气候，年平均气温22.4 ℃，降水量在1 700～1 800 mm之间，雨量充沛，云雾多，可谓“云滋雾养出名茶”，属生产名优茶叶的特佳产地。

目前评价茶的营养价值和保健功效主要从茶叶的茶多酚、总黄酮含量，茶叶抗氧化活性和还原能力等方面开展定量评价。总黄酮和茶多酚含量均是检测保健茶品质的关键指标[3， 24]，而且人们普遍认为总黄酮和茶多酚含量与抗氧化活性和还原能力成正比[25-27]。但也有研究结果显示，除黄酮和茶多酚之外，茶叶中还含有其它组分，如醇类、萜类、醛类、酮类、酸类、生物碱类和不饱和烃类等共同起作用 [28-29]，表现出相对复杂的关系。另外，茶叶中的总黄酮、茶多酚含量及抗氧化活性的大小，因品种不同或不同的研究人员所测定的结果而有一定的差异[27， 30]。一般茶叶中总黄酮含量为3%～7.85%[31-32]，茶多酚含量在8.6%～30%范围[33-34]。

在本研究中，7种茶叶的总黄酮含量在3.06%～5.4%之间，其中水满茶的总黄酮含量最高为5.4%，属茶叶中相对较高的水平；茶多酚含量在14.6%～18.1%之间，其中水满茶的茶多酚含量最低，为14.6%，属茶多酚含量一般水平的中偏低水平。从DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基和超氧自由基的清除率以及还原能力等方面比较了水满茶与普洱茶、白毛茶、白沙绿茶、西湖龙井、兰贵人和碧螺春的抗氧化活性。结果表明，水满茶清除ABTS自由基、羟自由基和超氧自由基的能力最强，还原能力处在中等水平，但对DPPH自由基清除能力最弱。这一结果反映出茶叶的抗氧化活性与其化学成分及含量存在相对复杂的关系，但总体上可看出水满茶具有较强的抗氧化活性和保健功能。

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