基于银薄膜/荷叶SERS效应直接检测婴儿配方奶粉中三聚氰胺

胡樱子 阴正源 肖桂娜

摘要：

以天然荷叶为衬底，结合真空磁控溅射法沉积银薄膜，制备出了一种高效的表面增强拉曼散射（SERS）活性基底.研究发现银/荷叶基底对婴儿配方奶粉中掺杂的三聚氰胺（MA）表现出良好的识别能力，而不需作额外的样品预处理.对掺杂不同浓度三聚氰胺的奶粉溶液进行定量分析，在5～50 mg/L质量浓度范围内获得了较好的线性关系（线性相关系数R2>0.99）.根据3σ准则，检测极限估计为1 mg/L.此外，银/荷叶基底具有良好的均匀性和重复性（相对标准偏差为7.64%和10.54%）.该方法对婴儿配方奶粉中三聚氰胺的检测具有简单快速、成本低且无损等优点.

关键词：

真空磁控溅射; 荷叶; 银薄膜; 表面增强拉曼散射（SERS）; 三聚氰胺; 婴儿配方奶粉

中图分类号： O 647文献标志码： A文章编号： 1000-5137（2018）01-0062-07

Direct detection of melamine in infant formula milk powder

based on SERS effect of silver thin film coated lotus-leaf

Hu Yingzi， Yin Zhengyuan， Xiao Guina*

（Mathematics and Sciences College，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract：

An efficient surface-enhanced Raman scattering （SERS） substrate has been developed by depositing silver thin film on natural lotus leaf （Ag/lotus-leaf） with vacuum magnetron sputtering method.It was found that the Ag/lotus-leaf substrate showed excellent ability to recognize melamine molecules in infant formula milk powder directly without any sample pretreatment.Quantitative analyses of melamine in milk powder solution at different concentrations were carried out.A good linear relationship was obtained at concentrations ranging from 5 mg/L to 50 mg/L，and the correlation coefficient （R2） of the curve was larger than 0.99.According to the rule of 3σ，the limit of detection is estimated to be 1 mg/L.Furthermore，the Ag/lotus-leaf substrate exhibited good uniformity and reproducibility with relative standard deviation （RSD） values of 7.64% and 10.54%.This method was

收稿日期： 2017-09-26

基金项目： 国家自然科学基金（61405116）;上海高校青年教师培养资助计划

作者简介： 胡樱子（1997-），女，本科生，主要从事表面增强拉曼光谱方面的研究.E-mail：1755060260@qq.com

*通信作者： 肖桂娜（1983-），女，副教授，主要从事功能纳米材料、表面增强拉曼光谱等方面的研究.E-mail：xiaoguina@shnu.edu.cn

引用格式： 胡櫻子，阴正源，肖桂娜.基于银薄膜/荷叶SERS效应直接检测婴儿配方奶粉中三聚氰胺 [J].上海师范大学学报（自然科学版），2018，47（1）：62-68.

Citation format： Hu Y Z，Yin Z Y，Xiao G N.Direct detection of melamine in infant formula milk powder based on SERS effect of silver thin film coated lotus-leaf [J].Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2018，47（1）：62-68.

simple，fast，nondestructive，and inexpensive for the detection of melamine in infant formula milk powder.

Key words：

vacuum magnetron sputtering; lotus leaf; silver thin film; surface-enhanced Raman scattering （SERS）; melamine; infant formula milk powder

0引言

三聚氰胺（MA）是一种重要的工业材料，大量应用于塑料、涂料、纺织和建筑等行业.作为一种含氮量高的分子，也被非法添加到牛奶、婴儿配方奶粉、宠物食品等中，以增加蛋白质测试含量[1].我国规定婴儿配方奶粉中三聚氰胺的质量浓度上限为1 mg/L，其他食品中的为2.5 mg/L.如果食品中三聚氰胺的含量超过安全标准，可能会导致人类和宠物肾功能衰竭，甚至死亡.

目前，检测三聚氰胺的方法主要有高效液相色谱法[2]、气相色谱质谱法[3]、毛细管电泳法[4]、酶联免疫吸附试验[5]等多种，各具特色.然而，这些方法一般需要复杂的样品预处理，昂贵的实验设备且耗时.为此，发展一种快速准确、实时灵敏的分析技术对食品中掺杂的三聚氰胺进行检测将是非常有意义的.作为研究物质结构的重要手段之一，拉曼光谱技术具有快速、准确、无损、适用广泛等特点，在食品非法添加剂、果蔬农药残留物等检测中发挥着积极作用[6-7].然而，普通的拉曼光谱技术存在散射效率低、散射信号弱及散射截面小的缺点，故很难获得高质量的谱图.

表面增强拉曼散射（SERS）技术是一种先进的表面分析技术，可以极大地增强吸附在某些金属（如金、银、铜等）表面物质的拉曼散射信号，并能提供吸附分子丰富的结构信息[8].由于具有无损、快速、灵敏度高、选择性强等特点，SERS技术被认为将在材料科学和生命科学领域得到广泛运用.近年来，国内外在利用SERS技术对三聚氰胺进行检测方面开展了一系列研究工作[9-14].Betz等[10]通过电位移反应在金属铜带或铜币上制备了一种简单、低廉和便携的银微米/纳米结构SERS基底，该基底可以直接检测婴幼儿配方奶粉中掺杂的三聚氰胺，而不需对样品进行提取、分离、净化或使用其他附加设备，检测限达5 mg/L.Li等[11]基于聚集Au@SiO2纳米粒子的SERS效应，对液态奶中三聚氰胺进行了简单快速探测，但仍需对奶粉样品进行预处理，如盐酸处理和两次离心分离.

本文作者以荷叶为衬底，利用真空磁控溅射法沉积银薄膜，该方法操作简便、成本低廉、重复性好且可批量生产.以银/荷叶为拉曼活性基底，对婴儿配方奶粉中掺杂的三聚氰胺进行直接检测.对比了三聚氰胺标准品的正常拉曼散射光谱（NRS）和奶粉中三聚氰胺的SERS光谱.对奶粉中掺杂不同浓度三聚氰胺的SERS光谱进行定量分析测试.对银/荷叶基底的均匀性和重复性也进行了研究.

1实验部分

1.1实验材料

使用的荷叶衬底为山东省微山湖纯野生荷叶，经人工采摘、充分阳光晾晒而成;三聚氰胺购于上海国药集团化学试剂有限公司;惠氏婴儿配方奶粉（灌装），产地新西兰;高纯银溅射圆形靶材，直径为10.16 cm，纯度为99.99%，购于北京中诺新材科技有限公司.称取三聚氰胺固体粉末10 mg和惠氏婴儿配方奶粉500 mg，分别加入去离子水定容至100 mL，得到质量浓度为100 mg/L的三聚氰胺标准溶液和质量浓度为5 g/L的奶粉标准溶液.将两者按一定的比例混合，分别得到三聚氰胺质量浓度为50，20，10，和5 mg/L的奶粉混合溶液.

1.2荷叶衬底上银薄膜的制备

在购买的干燥荷叶表面选取若干处平整无裂缝部位，剪裁成适当尺寸若干片，用去离子水洗净.用双面胶将洗净的干燥荷叶片平整地粘贴在纸基上.采用日本城南工业株式会社生产的SSP3-4型磁控溅射系统镀银薄膜.沉积室的本底压强为5×10-4 Pa，靶和衬底间的距离为5 cm，以氩气作为等离子生成气体.在磁控溅射过程中，溅射功率为50 W，工作压强为1 Pa，镀膜时间30 min.

1.3仪器和表征

采用日立公司生产的S4800场发射扫描电子显微镜（SEM）表征样品的表面形貌，加速电压为5 kV.拉曼散射光谱通过Horiba Jobin-Yvon公司生产的XploRATM精巧型全自动显微共焦拉曼光谱仪进行检测.拉曼光谱仪配有激发波长分别为532，638，和785 nm的三个激光器，可以自动切换激光波长.测试前，采用单晶硅520 cm-1特征峰对拉曼光谱仪进行校准.测试时，采用Olympus光学显微镜 （数值孔径为0.5，放大倍率为50倍）观察样品形貌.在检测SERS前，取含不同浓度三聚氰胺的奶粉混合溶液5 μL滴在荷叶/银基底表面.待液滴在基底表面自然干燥后，可进行SERS检测.为了获取最佳拉曼检测信号，且不损伤探针分子，入射在样品表面上的激光功率为0.1 mW，数据采集时间都小于10 s.测三聚氰胺标准水溶液的NRS光谱时，以规格为10 mm×10 mm×4.5 mm的石英比色皿作为样品池，不使用显微物镜，激光功率10 mW，积分时间10 s.

2结果与讨论

2.1形貌分析

众所周知，荷叶由于其微米级乳突和纳米级表皮蜡质结构，具有非常好的超疏水性和自清洁功能[15].为研究荷叶的微观结构，用光学显微镜（OM）和SEM研究购买的干燥荷叶的表面形貌，如图1（a）和（c）所示.荷叶表面随机分布了非常多微小的乳突.从SEM照片可以看出，微米级乳突上还覆盖有绒毛状蜡结构.微乳突结构和二级纳米结构是荷叶超疏水性的源点，构成荷叶表面的分层粗糙度.荷叶干燥过程中，微乳突宽度随着荷叶自身水分蒸发而增加，干燥的荷叶也保持超疏水性能.图1（b）和（d）为在荷叶衬底上沉积银薄膜的OM和SEM照片，可以明显观察到两种结构：微乳突结构和交叉银膜.由放大的SEM照片可知，银膜呈现不规则的棒状结构.独特的交叉结构能形成增强热点，纳米棒的聚集能促进电磁场的场强，以及微乳突结构的疏水性可以有效富集吸附分子，这都将有利于提高待测物的表面增强拉曼散射信號[16].

图1荷叶衬底银薄膜沉积前后的OM和SEM图.（a） 沉积前OM图;（b） 沉积后OM图;（c） 沉积前SEM图;

（d） 沉积后SEM图

2.2银/荷叶基底对奶粉中三聚氰胺的检测

图2三聚氰胺粉末和100 mg/L三聚氰胺标准

水溶液的NRS

图2为三聚氰胺粉末和水溶液的NRS.三聚氰胺典型的拉曼特征峰位于381，581，676，776，和984 cm-1处.其中，676 cm-1处的最强特征峰归属于分子环呼吸振动模式II，包含了三嗪环的环面内变形和氨基氮原子振动[17].位于984 cm-1处的第二最强峰归属于三嗪环的面内环呼吸振动模式I.而质量浓度为100 mg/L的三聚氰胺标准水溶液的NRS中，只观察到位于673 cm-1处较弱的特征峰.

图3不同激发波长下，吸附在银/荷叶上质量浓度为

50 mg/L三聚氰胺奶粉水溶液的SERS光谱

图3为吸附在银/荷叶基底上，质量浓度为50 mg/L的三聚氰胺奶粉水溶液的SERS光谱.比较研究同一检测位置上，激发波长分别为532，638，和785 nm的情况.三者的拉曼测试条件除了积分时间不同之外，其余均相同：激光功率为0.1 mW，积分次数为1次，三者的积分时间依次为：10，5，和10 s.由图3可知，在532 nm和785 nm激发波长下，三聚氰胺的特征峰均能被观察到，分别位于410，594，703，997 cm-1和390，581，690，987 cm-1.与固体三聚氰胺的NRS相比，532 nm激发比785 nm激发得到的特征峰发生了更大的位移，且峰值更高.例如，676 cm-1处的特征峰分别红移至703 cm-1和690 cm-1处.文献报道了吸附在空心金芯片[18]和金纳米粒子[19]基底上的三聚氰胺特征峰也发生了较明显的偏移，偏移量分别达36 cm-1和39 cm-1.在638 nm激发波长下，可以明显观察到位于683 cm-1处的特征峰，但在1 000 cm-1附近出现了很强的宽荧光带.

为了验证通过银/荷叶基底来检测未经任何预处理的三聚氰胺奶粉溶液的方案可行性，在婴儿配方奶粉溶液中掺杂不同浓度的三聚氰胺并滴在银/荷叶基底上直接进行测试，如图4（a）和4（c）所示.测试条件为：激光功率0.1 mW，积分时间10 s，而图4（a）和4（c）中激光的激发波长分别为532 nm和785 nm.通过对比两者的SERS光谱发现，即使在三聚氰胺浓度较低（5 mg/L）情况下，仍能在703 cm-1和690 cm-1处清晰地分辨出主要的三聚氰胺特征峰.在较高浓度（20 mg/L和50 mg/L）时，除主要的特征峰外，还能清晰地观察到其他三个峰.拉曼特征峰的强度随着三聚氰胺的质量浓度从50 mg/L降低至5 mg/L而同时减弱.

图4（b）和4（d）给出了703和690 cm-1处特征峰强度与奶粉溶液中三聚氰胺浓度间具有良好的线性关系，关系式分别为：I703=1 269.3+676.4 C，I690=-622.9+165.1 C，式中I703、I690分别为703 cm-1和690 cm-1处特征峰强度，C为三聚氰胺质量浓度，相关系数（R2）分别达到0.9983和0.9925.根据3σ规则（CLOD=3σ/K），检测限（LOD）估计为1 mg/L，符合2008年由美国食品药品监督管理局颁发的标准（2.5 mg/L），其中σ为标准偏差，K为线性拟合直线的斜率.

图4激发波长为（a） 532 nm和（c） 785 nm时，不同浓度三聚氰胺奶粉溶液的SERS光谱;特征峰

（b） 703 cm-1和（d） 690 cm-1处的强度与三聚氰胺浓度的函数关系及其线性拟合直线

2.3銀/荷叶基底的均匀性和重复性

众所周知，SERS技术作为一种常规分析工具的主要瓶颈是制备均匀、可重复和稳定的SERS活性基底，常用拉曼谱带强度的相对标准偏差（RSD）来评估基底的性能.为了研究银/荷叶基底的重复性，在相同的实验条件下，制备了6个不同的银/荷叶基底.图5（a）给出了吸附在不同银/荷叶基底上奶粉水溶液中三聚氰胺的SERS光谱.可以看出，各个基底上三聚氰胺的SERS光谱均被大大增强，由不同基底得到的谱线峰的位置几乎是一致的，6条谱线基本重合.为探讨银/荷叶基底的均匀性，图5（c）给出了在相同的测量条件下，同一衬底上随机选取11个三聚氰胺奶粉溶液点测得的SERS光谱.经计算，特征峰703 cm-1和690 cm-1的RSD值分别为10.54%和7.64%，如图5（b）和5（d）所示.可见银/荷叶基底具有较好的重复性和均匀性.

3结论

通过真空磁控溅射法在天然荷叶上沉积银薄膜，制备了银/荷叶基底.基于银/荷叶的SERS效应，提出了一种灵敏、快速、便宜且直接的婴儿配方奶粉中三聚氰胺的检测方法.该基底对奶粉中掺杂的三聚氰胺分子检测限约为1 mg/L，且在5～50 mg/L质量浓度范围内获得了较好的线性关系，其线性相关系数高于 0.99.结果表明该方法的检测速度快，检测效果良好，且不需对检测物作额外的分离或提纯处理.除此之外，银/荷叶基底还具有制备方法简便，可单次批量制备，重复性好等优点，具有较好的应用前景.

图5（a） 6个不同的银/荷叶基底上三聚氰胺奶粉溶液的SERS光谱;（c） 同一银/荷叶基底上随机

选择的11个三聚氰胺奶粉溶液点的SERS光谱;在（b） 703 cm-1和（d） 690 cm-1处

拉曼峰相应的峰值强度和相对标准偏差值

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