HPLC法同时测定云南小粒咖啡中4种成分的含量

邱碧丽 代丽玲 刘超 张绍龙 杨艳

摘要 [目的]建立云南小粒咖啡中绿原酸、葫芦巴碱、咖啡酸、D-（-）-奎宁酸含量的测定方法。[方法]采用Venusil ASB C18为色谱柱，甲醇-0.1%磷酸水为流动相，等度洗脱，流速0.9 mL/min，柱温35 ℃，检测波长：绿原酸和咖啡酸330 nm，葫芦巴碱和D-（-）-奎宁酸210 nm。[结果]绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸分别在14.6～146.0 μg/mL（r=1.000 0）、10.2～102.0 μg/mL（r=1.000 0）、11.6～116.0 μg/mL（r=0.999 8）、0.499 5～4.995 0 μg/mL（r=0.999 8）的浓度范围内与峰面积线性关系良好，加标回收率为93.28%～97.46%。[结论]该方法简便、准确、重复性好，可用于云南小粒咖啡中绿原酸、葫芦巴碱、咖啡酸和D-（-）-奎宁酸含量的测定。

关键词 云南小粒咖啡;绿原酸;葫芦巴碱;咖啡酸;D-（-）-奎宁酸;HPLC

中图分类号 TS273文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）34-0173-03

小粒咖啡亦称为阿拉比卡种（Arabica），茜草科（Rubiaceae）咖啡属大灌木或小乔的种子，是最传统的阿拉伯咖啡品种[1-2]。云南种植的咖啡主要为小粒种咖啡，占全国咖啡豆产量的98.80%[3]。咖啡中的绿原酸具有清除自由基、抗氧化[4]、抗癌[5-6]、抗菌及抗病毒[7-8]等功效;葫芦巴碱具有降血糖、抗肿瘤等作用[9-10];咖啡酸也具有抗菌、抗病毒、中枢兴奋等生物活性[11]。有关咖啡中绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸含量的测定方法研究鲜见报道。笔者建立了HPLC法同时测定云南小粒咖啡中绿原酸、葫芦巴碱、咖啡酸和D-（-）-奎宁酸含量的方法，以期为云南小粒咖啡质量标准的研究、咖啡豆的综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品。咖啡生豆分别采自保山市、普洱市、临沧市3个市的咖啡种植基地，品种均为卡蒂姆。焙炒咖啡豆：取搜集到的咖啡生豆的50%，进行烘焙;烘焙条件：中焙，烘焙时间10 min，温度200 ℃，色度值58。

1.1.2 仪器。U3000高效液相色谱仪（配置DAD检测器，美国戴安公司）;MS205DU电子分析天平（瑞士METTLERROLEDD公司）;EXceed-AC-24超纯水机（成都康宁实验专用纯水设备）;GT SONIC-P3超声波清洗仪（固特超声股份有限公司）。

1.1.3 试剂。甲醇（色谱级，天津市光复精细化工研究所）;磷酸（美国TEDIA）。标准品：绿原酸（德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH）;葫芦巴碱、咖啡酸、D-（-）-奎宁酸，均购自坛墨质检。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备。取葫芦巴碱、绿原酸、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸适量，精密称定，置25 mL容量瓶中，加0.1%的磷酸溶解并定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液（每1 mL含葫芦巴碱102 μg、绿原酸146 μg、咖啡酸4.995 μg、D-（-）-奎宁酸116 μg）。

1.2.2 供试品溶液的制备。咖啡豆研磨成粉末（过0.45 mm筛），准确称取咖啡生豆粉末0.5 g（焙炒咖啡粉1.0 g），置于50 mL容量瓶中，加入50%的甲醇约25 mL，超声提取20 min，将上清液滤入50 mL容量瓶中，滤渣再加入20 mL 50%甲醇，超声提取15 min，合并2次提取液，用50%甲醇定容至50 mL，摇匀，过0.45 μm滤膜，待测。

1.2.3 色谱条件。Venusil ASB C18柱（粒径5 μm，柱长250 mm×4.5 mm）;流动相为甲醇+0.1%磷酸=22+78，流速 0.9 mL/min，等度洗脱;检测波长：绿原酸和咖啡酸330 nm，葫芦巴碱和D-（-）-奎宁酸210 nm;柱温35 ℃;进样量10 μL。

1.2.4 方法学考察。

1.2.4.1 线性关系的考察。精密吸取“1.2.1”项下的混合对照品溶液2、4、6、8、10 μL，注入色谱仪，以进样量浓度为自变量（X）、色谱峰面积为因变量（Y），绘制标准曲线，建立回归方程。

1.2.4.2 精密度试验。精密吸取混合标准品溶液10 μL，按“1.2.3”色谱条件，连续进样6针，以绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸的峰面积作为考察指标，计算RSD值。

1.2.4.3 重复性试验。分别称取同一咖啡生豆供试品6份、焙炒咖啡豆供试品6份，按“1.2.2”方法制成供试品溶液，按“1.2.3”色谱条件进样，计算6份供试品中绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸的含量及RSD值。

1.2.4.4 穩定性试验。分别称取同一咖啡生豆供试品溶液1份、焙炒咖啡豆供试品溶液1份，按“1.2.3”色谱条件，分别于0、2、4、8、12、16、24 h进样，以绿原酸、葫芦巴碱、咖啡酸、D-（-）-奎宁酸的峰面积作为考察指标，计算RSD值。

1.2.4.5 加样回收试验。称取同一咖啡生豆和焙炒豆样品各3份，咖啡生豆粉每份约0.25 g，焙炒咖啡粉每份约0.5 g，分别加入适量的绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸混合标准溶液，按“1.2.2”方法制成供试品溶液，测定供试品中绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸的含量，并计算回收率及RSD值。

1.2.4.6 含量测定。取不同产地的咖啡生豆和焙炒豆，按“1.2.2”方法制成供试品溶液，按照“1.2.3”色谱条件测定咖啡中绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸的含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系的考察。以对照品溶液浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得出回归方程。结果显示（表1），绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸和咖啡酸分别在14.6～146.0 μg/mL（r=1.000 0）、10.2～102.0 μg/mL（r=1.000 0）、11.6～116.0 μg/mL（r=0.999 8）、0.499 5～4.995 0 μg/mL（r=0.999 8）的浓度范围内线性关系良好。

2.1.2 精密度试验。通过对混合标准品溶液重复进样6针，计算RSD值，结果见表2。绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸峰面积的RSD值分别为0.32%、0.25%、0.56%、0.71%，表明在此试验条件下仪器精密度良好。

2.1.3 重复性试验。通过对咖啡生豆及焙炒咖啡豆供试品各6份测定绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸的含量，发现RSD值均小于1.0%，表明该方法重复性良好。

2.1.4 稳定性试验。由表2可见，各成分RSD值均小于2%，表明咖啡溶液中绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸的含量在24 h内稳定。

2.1.5 加样回收试验。由表3可知，绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸的回收率分别为97.12%、97.46%、95.25%、93.28 %，RSD值分别为1.77%、0.80%、2.23%、2.42%。表明该方法准确、可靠，可用于咖啡中绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸的含量测定。

2.2 含量测定 由表4可知，绿原酸含量咖啡生豆中为30.54～38.15 mg/g，咖啡焙炒豆中为8.26～9.15 mg/g。在咖啡焙炒豆中葫芦巴碱含量较咖啡生豆略有下降，下降幅度为0.43～1.15 mg/g。咖啡豆中D-（-）-奎宁酸和咖啡酸含量在经过烘焙后也呈下降趋势，其中生豆中D-（-）-奎宁酸含量为7.00～8.03 mg/g，咖啡酸含量为0.031～0.035 mg/g;焙炒豆中D-（-）-奎宁酸含量为2.27～4.79 mg/g，咖啡酸含量为0.011～0.012 mg/g。3个咖啡产区之间咖啡豆中咖啡酸含量差异不大;保山市较临沧市及普洱市在绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸含量均偏高，临沧市、普洱市之间差异不大。

3 结论与讨论

该试验建立了云南小粒咖啡中绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸和咖啡酸的高效液相色谱定量分析方法，该方法较回流提取法简便、快速、高效，回收率高，各成分分离度良好，能较好地对绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸、咖啡酸进行定性及定量分析。系统适应性结果表明，该方法准确、可靠，可以用于咖啡中此类成分的分析。

绿原酸是咖啡生豆的主要成分，咖啡生豆经烘焙后，绿原酸含量明显降低。这是由于绿原酸是由奎宁酸和肉桂酸（或咖啡酸、阿魏酸、香豆酸）形成的内酯，其性质不稳定，在整个烘焙加热过程中，绿原酸酯键断裂，生成一系列非挥发性的内酯和挥发性的酚类（如儿茶酚，愈创木酚等）[12]，使得绿原酸含量急剧下降。

3个咖啡产区之间咖啡豆中咖啡酸含量差异不大;保山市较临沧市及普洱市在绿原酸、葫芦巴碱、D-（-）-奎宁酸含量均偏高，临沧市、普洱市之间差异不大，说明不同产地的小粒咖啡因生长的海拔、气候、土壤等不同，咖啡中化学成分含量存在差异。在进行不同地区的咖啡品质评价时，增加绿原酸、葫芦巴碱、咖啡酸、D-（-）-奎宁酸等指标的评价，能更加客观、科学、全面地分析咖啡豆的质量品质。

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