党参总皂苷纳米乳体外透皮性能及抗黑素瘤细胞研究

2018-05-14 08:59曹发昊张百胜马家宁王艳萍
安徽农业科学 2018年34期

曹发昊 张百胜 马家宁 王艳萍

摘要 [目的]研究党参总皂苷纳米乳处方组成,考察其体外透皮性能及抗黑素瘤细胞作用。[方法]根据药物溶解性和伪三元相图筛选党参总皂苷纳米乳处方,粒度分析仪测定其粒径;以大鼠皮肤为模型,透皮扩散仪研究党参总皂苷纳米乳体外透皮性能;以黑素瘤B16细胞为靶细胞,MTT法和形态观察法研究党参总皂苷纳米乳对黑素瘤细胞的毒性作用。[结果]党参总皂苷纳米乳处方确定为Cremophor EL40/PEG400/橄榄油/蒸馏水(质量比为28.66∶14.33∶8.25∶48.76),党参总皂苷含量为44.75 mg/mL,粒径为60.67 nm;党参总皂苷纳米乳12 h累积渗透量和稳态渗透速率分别是党参总皂苷水溶液的2.73、2.47倍;党参总皂苷纳米乳能促使黑素瘤细胞数量减少,出现空泡和细胞碎片,并且100~800 μg/mL党参总皂苷纳米乳对黑素瘤细胞增殖的抑制率大于相同浓度党参总皂苷水溶液。[结论]确定了党参总皂苷纳米乳处方组成,它能增强党参总皂苷透皮性能和抗黑素瘤作用,从而为纳米乳开发党参总皂苷透皮制剂提供参考。

关键词 党参总皂苷;纳米乳;透皮性能;黑素瘤细胞

中图分类号 S859.5+3文献标识码 A文章编号 0517-6611(2018)34-0001-04

党参(Codonopsis pilosula)为桔梗科植物党参等的干燥根,是我国传统补益类中药,现代药理研究发现它具有延缓衰老、抗疲劳、抗缺氧、抗辐射、增强机体免疫力等功效[1-2]。党参总皂苷是党参发挥药理功效的重要成分,具有降血脂、神经保护、抗突变、抗炎等作用[3-6]。黑素瘤是一种高度恶性的肿瘤,大多原发于皮肤,易经淋巴管或血液转移[7]。党参总皂苷对黑素瘤作用的研究鲜见报道,纳米乳作为给药载体具有許多优点,已成为经皮给药研究的热点[8-9]。皂苷本身是一类很好的天然乳化剂,在纳米乳中可以作为药物成分,且具有表面活性剂的性质,故其在纳米乳药物载体开发研究中有很好的应用潜力[10]。笔者研究了党参总皂苷纳米乳体外透皮性能和抗黑素瘤细胞作用,以期为党参总皂苷透皮制剂的研究开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂。

党参总皂苷,自制;Cremophor EL40,德国BASF;PEG400,西安天正药用辅料有限公司;橄榄油,江西省吉水中南天然香料油厂;辛酸癸酸甘油三酯,武汉远成共创科技有限公司;Tween-80、Span-80、1,2-丙二醇、甲醇,江苏省海安石油化工厂;人参皂苷Re标准品,中国食品药品检定研究院;香草醛,西安拉维亚生物科技有限公司;高氯酸,天津市鑫源化工有限公司。

1.1.2 仪器。

Zetasizer Nano ZS激光粒度分析仪,英国Malvern Instrument公司;TT-6药物透皮扩散仪,天津市正通科技有限公司;UV-2102型紫外分光光度计,尤尼柯仪器有限公司;128C酶标仪,奥地利CliniBio公司;CO2恒温培养箱,日本三洋公司;倒置显微镜,上海光学仪器一厂。

1.1.3 试验动物和细胞。SD大鼠,第四军医大学试验动物中心;黑色素瘤B16细胞株,中国科学院上海细胞生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 党参总皂苷纳米乳处方筛选。室温下,将党参总皂苷分别溶于表面活性剂(Cremophor EL40、Tween-80、Span-80)、助表面活性剂(PEG400、1,2-丙二醇)、油(辛酸癸酸甘油三酯、橄榄油)中,涡旋振荡,直至不再溶解,测定药物在各溶剂中的溶解情况。

将表面活性剂和助表面活性剂按质量比(Km)混匀,得到混合表面活性剂(Smix);将油相(Oil)和Smix混匀,得到混合油相;在混合油相中缓慢滴加水相,不断搅拌,直至形成透明的体系,记下体系发生透明或浑浊变化时的各组分用量,用origin8.5绘制伪三元相图。根据纳米乳区大小,筛选合适的纳米乳体系。

1.2.2 党参总皂苷含量测定。

人参皂甙Re标准品用甲醇溶解,配制1.2 mg/mL标准品母液。移取标准品母液30、60、90、120、150 μL于具塞试管中,60 ℃水浴中蒸干,经香草醛-高氯酸-冰醋酸显色反应后,以试剂空白(随行处理的甲醇)为参比溶液,分光光度计测定吸光度,绘制标准曲线[11]。

移取待测样品7 mL,用甲醇溶解定容到50 mL容量瓶中,从中移取120 μL经香草醛-高氯酸-冰醋酸显色反应后,分光光度计测定吸光度,计算样品中党参总皂苷的含量。

1.2.3 党参总皂苷纳米乳粒径测定。样品用蒸馏水稀释后,激光粒度分析仪测定粒径。

1.2.4 体外透皮试验。党参总皂苷用蒸馏水配成质量浓度44.70 mg/mL党参总皂苷水溶液。在透皮扩散仪接收池中加入生理盐水接收液,将鼠皮固定在扩散仪上,移取1 mL待测液加到供给池中,开启扩散仪(温度设定为37 ℃,转速300 r/min),定时取样,取样后补加等体积接收液,分光光度计测定接受液中药物含量,计算药物累积渗透量Qn[12]。

1.2.5 体外抗黑素瘤细胞试验。试验分为无细胞对照组(只加不含细胞的培养液)、正常对照组和用药组(空白纳米乳组、党参总皂苷水溶液组、党参总皂苷纳米乳组)。96孔板中每孔接种200 μL B16黑素瘤细胞悬液,37 ℃ 5%CO2培养,当细胞生长融合到70%~80%时,弃去原培养液,用药组加入含药培养液,正常对照组加入不含药培养液。培养48 h后,每孔加入MTT溶液20 μL,继续培养4 h后,弃培养液,每孔加入150 μL DMSO,避光振荡10 min,酶标仪490 nm处测定A,计算细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率=(1-A用药组A正常对照组)×100%

1.2.6 数据分析。数据结果用±s表示。

2 结果与分析

2.1 党参总皂苷纳米乳处方筛选

2.1.1 党参总皂苷溶解性试验。

室温下,党参总皂苷在表面活性剂中溶解性排序依次为Cremophor EL40、Tween-80、Span-80;在助表面活性剂中溶解性排序依次为PEG400、1,2-丙二醇;在油相中溶解性排序依次为橄榄油、辛酸癸酸甘油三酯,故选择Cremophor EL40、PEG400、橄榄油用于确定党参总皂苷纳米乳组成。

2.1.2 伪三元相图研究纳米乳形成。

分别以Cremophor EL40、PEG400、橄榄油和蒸馏水为表面活性剂、助表面活性剂、油相和水相,伪三元相图考察了Cremophor EL40/PEG400质量比Km(2∶1、1∶1、1∶2)对纳米乳形成的影响(图1),图中黑色部分代表纳米乳区。纳米乳区大小排序为(Km=2∶1)>(Km=1∶1)>(Km=1∶2)。

2.1.3 党参总皂苷纳米乳组成确定。

在相图考察纳米乳形成情况的基础上,根据纳米乳区的大小,初步筛选出Cremorphor EL40/PEG400/橄榄油/蒸馏水2个纳米乳体系(Km=2∶1和Km=1∶1),测定药物在其中的溶解情况。党参总皂苷在Km=2∶1纳米乳中的含量较高,最终确定党参总皂苷纳米乳的组成为党参总皂苷/Cremophor EL40/PEG400/橄榄油/蒸馏水(质量比为4.50∶28.66∶14.33∶8.25∶48.76)。

2.2 党参总皂苷含量

2.2.1 标准曲线绘制。

分别以吸光度A和标准品质量为纵坐标和横坐标,绘制标准曲线(图2)。标准曲线方程:A=4.533 3C+0.031 0(R = 0.999 6),在0.036~0.180 mg时线性关系好。

2.2.2 党参总皂苷纳米乳药物含量。

选取3批次党参总皂苷纳米乳测定药物含量,所得结果见表 纳米乳中党参总皂苷含量为44.75 mg/mL。

2.3 党参总皂苷纳米乳粒径

粒径测定结果见图3,党参总皂苷纳米乳粒径为60.67 nm,多分散指数PDI为0.347,粒径介于10~100 nm,达到纳米乳要求。

2.4 党参总皂苷纳米乳体外透皮性能

党参总皂苷纳米乳12 h体外透皮的累积渗透曲线见图4。党参总皂苷纳米乳12 h累积渗透量为426.17 μg/cm 是党参总皂苷水溶液(155.98 μg/cm2)的2.73倍。党参总皂苷纳米乳和党参总皂苷水溶液的累积渗透曲线分别为Qn=37.53t-40.07、Qn=15.21t-27.23,两者的稳态渗透速率J分别为37.53、15.21 μg/(cm2·h),可见党参总皂苷纳米乳的稳态渗透速率J是党参总皂苷水溶液的2.47倍,这表明纳米乳有助于提高党参总皂苷的透皮性能。

2.5 党参总皂苷纳米乳体外抗黑素瘤细胞作用

2.5.1 细胞形态观察。

空白对照组处理的黑素瘤细胞形态有梭形、多角形等,细胞饱满,数量多(图5A);

和空白对照组相比,空白纳米乳作用48 h后黑素瘤细胞的形态变化不大,有梭形、多角形,但细胞密度有所减少(图5B);党参总皂苷水溶液组的黑素瘤细胞数量减少,细胞变圆皱缩,某些细胞出现空泡样结构(图5C);和党参总皂苷水溶液相比,党参总皂苷纳米乳作用48 h后,贴壁细胞数量明显减少,大量细胞变圆,并且出现大空泡样结构,甚至细胞膜发生破裂,培养液可见细胞碎片(图5D)。

2.5.2 党参总皂苷纳米乳对黑素瘤细胞增殖的影响。

MTT法测定党参总皂苷纳米乳对黑素瘤细胞增殖的影响,结果见表2。100~800 μg/mL空白纳米乳对黑素瘤细胞增殖的最大抑制作用为8.56%,按毒性分级法评价,空白納米乳对细胞的毒性为1级,达到合格要求[12]。100~800 μg/mL党参总

皂苷纳米乳对黑素瘤细胞增殖的抑制率大于相同浓度党参总皂苷水溶液,这表明纳米乳能增强党参总皂苷对黑素瘤细胞增殖的抑制作用。

3 讨论

纳米乳主要是由表面活性剂、助表面活性剂、油相和水相在合适配比下形成的透明体系,正是在这4种主要纳米乳成分作用下,药物能很好地溶解在纳米乳中[13]。笔者首先考察了多种溶剂对药物的溶解情况,从而确定了合适的表面活性剂(Cremophor EL40)、助表面活性剂(PEG400)、油相(橄榄油),用于进一步筛选党参总皂苷纳米乳的组成。表面活性剂和助表面活性剂是纳米乳的重要组成成分,主要是调节油水界面张力的,它们的配比对纳米乳形成有很大影响,故用伪三元相图研究纳米乳形成情况,确定合适的表面活性剂和助表面活性剂质量比Km,从而确定党参总皂苷纳米乳的组成[14]。皂苷本身有一定的乳化特性,有资料报道了皂苷可以作为天然表面活性剂用于制备纳米相关药物[15]。后续工作可以针对皂苷天然表面活性制备纳米乳进行研究,以降低纳米乳中合成表面活性剂的用量,减轻其毒副作用。

该研究发现,纳米乳能提高党参总皂苷的透皮性能,可能是由于纳米乳粒径小,表面张力低,易于浸润角质层,使角质层水化膨松,改变了角质层结构,细胞间隙扩大,形成了透皮的孔道;纳米乳作为药物储存库,增大了皮肤两侧药物的渗透浓度[16-19]。在研究体外抗黑素瘤细胞作用时,空白纳米乳对黑素瘤细胞的毒性等级为1级,表明空白纳米乳药物载体对黑素瘤细胞的安全性达到合格要求;党参总皂苷纳米乳对黑素瘤细胞增殖的抑制作用强于党参总皂苷水溶液,表明纳米乳能增强党参总皂苷的抗黑素瘤细胞作用,原因可能在于纳米乳粒径小,含有表面活性剂,易于和细胞膜相互作用,利于药物吸收;富集药物,起到药物贮存库的作用[20]。后续工作需要深入研究党参总皂苷纳米乳和皮肤、黑素瘤细胞的作用机制,从而更好地解释纳米乳的透皮性能和抗黑素瘤细胞作用。

4 結论

党参总皂苷纳米乳组成为Cremophor EL40/PEG400/橄榄油/蒸馏水(质量比28.66∶14.33∶8.25∶48.76),党参总皂苷含量为44.75 mg/mL,其粒径为60.67 nm,多分散指数PDI为0.347;党参总皂苷纳米乳的透皮性能和抗黑素瘤细胞增殖作用强于党参总皂苷水溶液,从而为利用纳米乳药物载体开发党参总皂苷透皮制剂提供依据。

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