猪传染性胃肠炎病毒S1融合蛋白的构建及其免疫原性研究

王芳　徐进平

摘要 [目的]研究猪传染性胃肠炎病毒S1融合蛋白的免疫原性。[方法]表达和纯化了猪传染性胃肠炎病毒S1与TAT转导肽序列的融合蛋白S1-TAT，将融合蛋白S1-TAT经腹腔注射和灌胃方式免疫昆明小鼠，采集免疫小鼠血液和粪便样品，检测血清IgG抗体和黏膜IgA抗体水平，期间观察小鼠体重变化。[结果]腹腔注射组诱导产生的血清IgG抗体水平明显高于其他试验组（P<0.01），但其黏膜IgA抗体水平较低；而灌胃组能够诱导中等水平的血清IgG抗体和较高水平的黏膜IgA抗体（P<0.01）；在试验周期中，各组小鼠体重均正常。融合蛋白S1-TAT的穿肠活性较好，与对照组之间差异极显著（P<0.01）。[结论]融合蛋白S1-TAT经口服或注射小鼠后，能够有效诱导小鼠机体产生体液免疫应答，并且融合蛋白S1-TAT经口服可诱导小鼠机体产生黏膜免疫应答；融合蛋白S1-TAT具有穿肠功能；融合蛋白S1-TAT经口服或注射小鼠，均安全。

关键词 猪传染性胃肠炎病毒S1基因；转导肽；免疫原性

中图分类号 S852.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）13-0104-04

Construction and Immunogenicity of Transmissible Gastroenteritis Virus S1 Fusion Protein

WANG Fang，XU Jinping

（State Key Lab of Viral，School of Life Science，Wuhan University，Wuhan，Hubei 430072）

Abstract [Objective] To investigate the immunogenicity of fusion protein S1TAT consisting of transmissible gastroenteritis virus S1 and transcriptional activator protein （TAT）. [Method] The recombinant plasmid S1TAT was expressed in prokaryotic system and purified. Kunming mice were immunized with fusion protein S1TAT by intraperitoneal injection and intragastric administration respectively， collected the blood and stool samples of mice and determined for serum IgG and mucosal IgA antibody， observed the change of bodyweight. [Result] The level of serum IgG antibody of intraperitoneal injection group was significantly higher than other groups （P<0.01）， but mucosal IgA antibody was lower. However， the intragastric administration group induced a moderate level of serum IgG antibody and higher level of mucosal IgA antibody （P<001）. Throughout the immune process， the bodyweight of each group was within the normal range. The intestine activity of fusion protein S1TAT was better compared with the control group （P<0.01）. [Conclusion] The fusion protein S1TAT can effectively induce the humoral immune response in mice after oral administration or injection， and the mucosal immune response can be induced by oral administration. The fusion protein S1TAT has intestinal function. It is safe to immune mice by oral administration or injection.

Key words Transmissible gastroenteritis virus S1 gene；Transduction peptide； Immunogenicity

豬传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）是一种可以引起以幼猪呕吐、腹泻和高死亡率为主要特征的急性传染肠道疾病的RNA病毒[1]。纤突糖蛋白S作为诱导保护免疫的主要结构蛋白[2-3]，在其氨基末端S1区域含有4个主要抗原位点，从N端到C端依次是C、B、D和A[4]。A位点是能够诱导机体产生中和抗体的关键糖基化位点[5]，存在于病毒粒子的表面上；D位点虽不经过细胞内的糖基化修饰作用，但应用仅含D抗原位点基因免疫小鼠产生的血清特异性抗体也具有中和活性。如果S基因中缺乏A、D这2个位点，那么表达的蛋白质就不能诱导机体产生中和抗体[6-7]。另外有研究表明，TGEV S1基因诱导产生的免疫效果要优于S全基因[8-9]。

目前，TGEV S1基因已在多种不同的表达系统中得到了有效的表达[10]，但在通过口服方式免疫动物时，由于各种消化酶作用以及本身大分子性质，达不到很好的免疫效果。该研究借助能够携带外源蛋白穿过细胞膜的TAT转导肽序列[11-13]，将其与S1基因进行融合表達，比较融合蛋白S1-TAT以不同给药方式免疫小鼠产生的免疫效果，为TGEV口服疫苗的研究提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒。大肠杆菌E.coli BL21 （DE3）、质粒pGEX-6p-1为武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室保存。

1.1.2 生化试剂。质粒小提取试剂盒和ELISA试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，Bio-Rad ECL化学发光检测试剂盒（170-5061）、GST-Resin纯化柱购自七海生物，HRP标记的羊抗鼠IgG和HRP标记的羊抗鼠IgA购自佰泰科生物技术有限公司，抗GST血清为武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室保存。

1.1.3 试验动物。SPF级别6～8周龄的雄性昆明小鼠购自湖北省疾控中心的实验动物研究中心。

1.2 方法

1.2.1 基因合成与鉴定。参照TGEV TH-98株S1基因序列（KU729220），在S1基因C端融合TAT转导肽序列，并将重组基因S1-TAT克隆至表达载体pGEX- 6p-1中。用pGEX -6p-1通用引物（上游引物F：5'-GGGCTGGCAAGCCACG TTTGGTG-3'；下游引物R：5'-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3'）扩增S1-TAT基因，经BamH Ⅰ/EcoRⅠ双酶切及基因测序鉴定重组质粒为pGEX-6p-1-S1-TAT。

1.2.2 重组工程菌的制备。将实验室保存的大肠杆菌E.coli BL21 （DE3） 接种于LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600为0.6左右。取1.5 mL菌液离心，弃上清，加入200 μL预冷的0.1 mol/L氯化钙轻轻摇动重悬菌体沉淀，冰浴30 min。4 ℃、4 000 r/min离心10 min后弃上清，加入100 μL预冷的0.1 mol/L氯化钙重悬菌体，得到制备好的E.coli BL21 （DE3） 感受态细胞。取1 μL重组质粒pGEX-6p-1-S1-TAT转化E.coli BL21 （DE3） 感受态细胞，将转化产物均匀涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃培养过夜，经菌液PCR鉴定阳性重组子。

1.2.3 融合蛋白S1-TAT的表达与纯化。挑取转化有重组质粒的单菌落接种于5 mL选择性LB液体培养基中，37 ℃过夜培养。次日，按1 ∶100的比例转接到20 mL选择性LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600约为0.6时，加入0.5 mmol/L的IPTG诱导剂，30℃、250 r/min振荡培养4 h。将菌液在4 ℃、10 000 r/min离心1 min，收集菌体沉淀，加入pH 7.4 PBS缓冲液进行重悬，400 W超声破碎至菌液不再黏稠后，12 000 r/min离心10 min，取少量样品加入适当上样缓冲液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和Western blot分析。将破碎上清溶液与GST纯化柱在4 ℃孵育过夜，4 ℃、3 000 r/min离心5 min。缓慢去除上清液，加入PBS清洗杂蛋白，4 ℃、3 000 r/min离心5 min。缓慢去除上清液后，加入pH 8.0 Elution buffer，室温轻摇10 min，4 ℃、3 000 r/min离心5 min，收集上清液，SDS-PAGE电泳分析蛋白纯化情况。

1.2.4 试验动物分组、免疫和采样。将昆明小鼠随机分4组，每组8只。融合蛋白S1-TAT分别经腹腔注射和灌胃给药免疫昆明小鼠，每只小鼠每次免疫剂量100 μg，共免疫3次，间隔14 d以相同剂量加强免疫1次，同时设置PBS对照。在首次免疫后的第7、14、21、28、35和42天收集免疫小鼠血液和粪便样品：全血37 ℃静置1 h后，4 ℃放置过夜，次日4 ℃、2 000 r/min离心20 min，分离血清；每0.1 g粪便用200 μL 0.01 mol/L的PBS充分混匀，4 ℃作用1.5 h，离心收集上层液体。

1.2.5 抗体检测。将融合蛋白S1-TAT以100 μL/孔包被酶标板，4 ℃放置过夜；次日弃除孔中液体，PBST反复洗涤3次，按200 μL/孔加入5%脱脂奶粉，37 ℃封闭2 h；弃除孔中液体，PBST洗涤3次，按100 μL/孔加入适当倍数稀释好的待检样品，37 ℃孵育2 h；弃除孔中液体，PBST洗涤5次，按100 μL/孔加入1 ∶5 000稀释的二抗（HRP标记羊抗鼠IgG抗体或HRP标记羊抗鼠IgA抗体），37 ℃孵育2 h；弃除孔中液体，PBST洗涤5次，每孔加入100 μL OPD底物溶液，避光显色5 min后终止反应，测定样品的OD值。

1.2.6 迟发型超敏反应。将融合蛋白S1-TAT与氟氏完全佐剂按比例充分混匀后注射于小鼠的右后足垫皮下，注射量为10 μg，并在同一小鼠左后足垫皮下注射PBS缓冲液。用千分卡尺测量注射抗原后24、48、72 h以及7、14 d小鼠的左右足垫厚度，观察肿胀的发生和消长情况，结果以++、+、-表示（++代表明显肿胀；+代表轻度肿胀；-代表无肿胀）。

1.2.7 融合蛋白S1-TAT的穿肠活性检测。取5 cm昆明小鼠肠管，用PBS缓冲液冲洗小鼠肠管，将肠管一端扎紧，用移液枪吸取浓度为100 μg/mL的融合蛋白S1-TAT至扎好的小鼠肠管，扎好肠管另一端，投入装有10 mL PBS缓冲液的试管中，并使PBS缓冲液完全浸没小鼠肠管，设置阴性对照，30 ℃下静置，间隔1 h取样，ELISA方法检测待检样品。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的鉴定 重组质粒pGEX-6p-1-S1-TAT为模板，用引物扩增S1-TAT序列，PCR鉴定重组质粒。用BamH Ⅰ 和EcoR Ⅰ 酶双酶切重组质粒pGEX-6p-1-S1-TAT，酶切鉴定重组质粒。结果如图1所示，PCR和双酶切后，瓊脂糖凝胶电泳均见有1.2 kb的S1-TAT基因。经后续测序鉴定，重组质粒pGEX-6p-1-S1-TAT构建正确。

2.2 融合蛋白S1-TAT的诱导表达 将重组质粒pGEX-6p-1-S1-TAT转化大肠杆菌E.coli BL21 （DE3） 以0.5 mmol/L IPTG、30 ℃诱导表达4 h。诱导后的S1-TAT原核表达重组大肠菌在分子量

约为70 kD出现特异性蛋白条带，与预期的融合蛋白大小基本一致（图2）。

相对应未经诱导的重组大肠菌没有出现此条带，而诱导的空载体pGEX-6p-1对照重组大肠菌在26 kD左右出现GST蛋白条带，上述结果初步表明融合蛋白S1-TAT在大肠杆菌中获得表达。

2.3 融合蛋白S1-TAT的Western blot鉴定结果 将重组表达菌E.coli BL21（DE3） （pGEX-6p-1-S1-TAT） 进行小量诱导，诱导后的菌体经过SDS-PAGE电泳分离后转移到NC膜上，ECL化学发光检测结果。结果显示，这些表达与GST融合的蛋白能被抗GST的单克隆抗体识别，蛋白条带大小与预期符合，证实融合蛋白S1-TAT在大肠杆菌中得以表达正确（图3）。

2.4 融合蛋白S1-TAT的纯化 收集诱导后E.coli BL21（DE3） （pGEX-6p-1-S1-TAT） 破碎液上清，将其与GST纯化柱4 ℃过夜孵育后，用适量PBS洗去杂蛋白，最后用pH 8.0的还原性谷胱甘肽洗脱液洗脱目的蛋白，从而获得纯化蛋白（图4）。

2.5 免疫小鼠的血清IgG抗体水平 融合蛋白S1-TAT经腹腔注射和灌胃给药方式免疫昆明小鼠的42 d内，间隔7 d随机取3只试验小鼠断尾取血，分离血清。血清IgG抗体ELISA检测结果显示（图5），腹腔注射组小鼠在免疫后第7天即产生了特异性IgG抗体，与阴性对照组之间差异极显著（P<0.01），其抗体水平随着免疫次数的增加和时间的延长逐渐升高。而灌胃组小鼠在免疫后第14天才开始有抗体产生，且抗体水平上升缓慢，与阴性对照组之间差异极显著（P<0.01），整个免疫过程中抗体水平低于腹腔注射组。

2.6 免疫小鼠的黏膜IgA抗体水平 在首次免疫后的第7、14、21、28、35和42天，采集腹腔注射组和灌胃组免疫小鼠的粪便样品，间接ELISA检测肠道黏膜IgA抗体。结果显示（图6），灌胃组小鼠在免疫7 d后，体内产生了较高水平的黏膜IgA抗体，与阴性对照组的差异达到极显著（P<0.01）。随着免疫次数的增加，灌胃组黏膜IgA抗体在第35天上升至最高，免疫后第42天抗体略微下降，但仍处于相对较高的水平（P<0.01）。而腹腔注射组小鼠在整个免疫过程中，体内的黏膜IgA抗体一直处于较低水平。

2.7 对小鼠体重的影响 体重是衡量个体体质状况的重要标志之一，在一定程度上可以反映出小鼠的生长发育水平。首次免疫后间隔14 d称量计算小鼠的平均体重，比较各组小鼠的体重变化，结果显示（图7），各组之间差异不显著（P>0.05），表明融合蛋白S1-TAT不影响小鼠的体重变化，可以初步评价为比较安全可靠的免疫原。

2.8 迟发型超敏反应 小鼠足垫肿胀试验是用于测定动物能否出现迟发型超敏反应及其强度的一种方法[14]。由表1可知，昆明小鼠的右后足垫在注射融合蛋白S1-TAT后的24 h左右出现轻度红肿，随着时间的延长红肿明显，至72 h反应达到高峰。此后，肿胀反应减轻，第14天小鼠足垫厚度基本恢复正常。而同一昆明小鼠的左后足垫免疫PBS缓冲液后未见足垫肿胀反应。

2.9 融合蛋白S1-TAT的穿肠活性 取小鼠肠管作为研究融合蛋白S1-TAT穿肠功能的生物膜屏障，检测肠管外环境中融合蛋白S1-TAT的吸光值。结果如图8所示，小鼠肠管外融合蛋白S1-TAT在静置1 h后开始上升，随着时间的延长，管外的融合蛋白S1-TAT持续上升，在静置4 h后达到最大值，5 h略有下降，与PBS对照组之间的差异均达到极显著水平（P<0.01），证实S1蛋白在TAT转导域介导下能够有效地穿过小鼠肠壁细胞。

3 讨论

近年来，对如何防治猪传染性胃肠炎病毒的研究越来越多，TGEV S1基因作为诱导免疫中和反应的核心序列，利用其翻译的S1蛋白制作亚单位疫苗具有良好的可行性。然而，在将S1蛋白亚单位疫苗通过注射方式免疫小鼠时，虽然能够诱导机体产生较高水平的血清IgG抗体，但TGEV主要攻击宿主的肠道组织，肠道黏膜免疫所产生的分泌型IgA抗体才是抵抗该病毒的有效抗体，而IgG等血清抗体对黏膜感染的病毒免疫保护效果并不理想。相比之下口服免疫作为一种简单可行的免疫接种途径，有着可以诱导产生黏膜IgA抗体的优势。但亚单位疫苗本身是蛋白质，在经口服免疫时容易被胃环境中的各种消化酶降解而最终失去免疫原性，且很难穿过肠系膜进入到血液循环中，导致了能够产生有效的黏膜IgA抗体的基因工程疫苗依旧缺乏。但有研究发现，在自然界中存在着一类能够安全有效地实现外源生物大分子穿过生物膜结构的蛋白转导域家族，其中研究较多且较为深入的便是TAT蛋白转导肽，它的发现为TGEV口服亚单位疫苗的研究提供了新的思路。

该研究基于TGEV S1基因的诱导中和抗体作用及TAT转导肽的跨膜转导特性，首次将S1与TAT转导肽进行融合，成功构建了重组质粒pGEX-6p-1-S1-TAT，并表达与纯化了融合蛋白S1-TAT。为了研究融合蛋白S1-TAT经口服和注射小鼠后体内的免疫应答方式，该研究比较了2种不同给药方式诱导产生的抗体水平。结果显示，腹腔注射组能够诱导产生较高水平的血清IgG抗体，产生速度较快，但其黏膜IgA抗体一直处于较低水平；而灌胃组除了可以诱导小鼠产生中等水平的血清IgG抗体之外，其黏膜IgA抗体水平也是显著高于其他试验组（P<0.01）。以上结果说明融合蛋白S1-TAT经口服或注射小鼠后，能够有效诱导小鼠机体产生体液免疫应答，并且融合蛋白S1-TAT经口服可诱导小鼠机体产生黏膜免疫应答，为口服抗TGEV基因工程疫苗的研制提供一定的参考价值。

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