浅析猪伪狂犬病的诊断技术

何明生

摘 要：本文概述了猪伪狂犬病的临床、病原学、血清学以及分子生物学诊断技术，以期为寻找合适的快速、准确的检测方法、制定合理的免疫程序和发展新型的检测方法提供参考。

关键词：猪伪狂犬病；诊断；应用

中图分类号：S858.28 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2018）05-0024-02

猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的，不同生长阶段的猪都可发病的一种急性、高度接触性传染病，其特征症状为发热、繁殖障碍、脑脊髓炎等。目前该病在全世界广泛分布，并有不断蔓延扩大的趋势。任何年龄的猪对伪狂犬病毒耐过后均能形成潜伏感染，且终生带毒，在一定条件下会引起复发性感染并向外散毒，因此，开发出快速、准确的诊断方法对猪伪狂犬病的预防、控制具有十分重要的意义。

1 临床诊断

临床诊断就是根据伪狂犬病典型的临床症状、流行病学特点、病理剖检、发病史等信息判断猪是否患病的过程。猪患伪狂犬病的临床症状在不同生长时期、不同性别表现不同。新生仔猪主要表现为神经症状，消化系统受损，其中对2～3周龄的仔猪来说死亡率可高达100%；妊娠母猪感染主要表现为流产，产死胎、木乃伊胎等现象；公猪感染则呈现繁殖障碍以及呼吸系统症状。隐性感染的猪不表现明显的临床症状，需进行实验室诊断来确诊，以便及时隔离感染猪，控制感染的蔓延。

2 病原学诊断

病原学诊断方法主要包括：病毒分离、病毒接种和动物感染，该法被称为PRV诊断的黄金标准，但存在敏感性较差的问题。通常取鼻咽拭子、阴道拭子以及组织病料，处理后接种在适宜细胞上，待细胞出现病变后，进行镜检或进一步电镜鉴定。而后将分离出的病毒接种到实验动物上，观察动物的发病情况。

3 血清学诊断技术

简单、快捷、敏感是血清学诊断技术的特点，目前诊断PR常用的血清学方法有：酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）、乳胶凝集试验（Latex Agglutination Test，LAT）、血清中和试验（Serum Agglutination Test，SNT）、琼脂免疫扩散试验（Agar Gel Immunodiffusion，AGID）、血凝（Hemagglutination，HA）试验和血凝抑制（Hemagglutination Inhibition，HI）试验。其中ELISA、LAT和SNT被列为国际贸易指定实验技术。

3.1 ELISA

ELISA是在固体载体上以物理方法将抗体（或抗原）进行吸附，随后在此固相载体上进行一系列免疫学和酶促生化反应的免疫酶测定实验，具有特异﹑敏感﹑快速﹑简便的优点，适用于实验室大批量样本的检测﹑产地检疫及流行病学调查等。

3.2 LAT

LAT是利用抗原和抗体特异性结合的特点，先用乳胶将抗原包被，紧接着与相应血清进行反应，结果可在几分钟内得出，具有操作简单﹑方便﹑快速等特点。邱德新等应用LAT对来自35个猪场的414份血清进行了PRV的抗体检测，检出168份阳性，阳性率为98.2%。

3.3 SNT

SNT是世界上多数国家诊断PR的法定方法之一，其敏感性和准确性都较为理想，但操作烦琐，且受技术、细胞等条件限制，不适合作为流行病学调查和大批量免疫监测的使用。

4 分子生物学诊断方法

分子生物学诊断技术的敏感性和特异性均高于现有的血清学方法，是诊断疾病最敏感和最特异的方法。尤其当伪狂犬病毒隐性感染时，仅靠临床诊断无法正确判断，使用分子生物学技术可以做出最为细致的判别，从而及时隔离出病猪，保障养殖户的经济效益。

4.1 聚合酶链反应技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）

PCR的原理与细胞内DNA的复制过程十分类似，双链DNA分子在临近沸点时分离成单链的DNA分子，然后以单链DNA为模板，DNA聚合酶利用反应混合物中的4种脱氧核苷酸（dNTP）合成新生的互补链。PCR反应可在数个小时之内将几个拷贝基因放大数百万倍。PCR法检测速度快，适合PRV的临床诊断以及流行病学调查。该技术中使用的引物和探针合成方便且适合保存，检测时间短，结果可靠，同时还避免了散毒，尤其适合无PRV国家的检疫。

4.2 核酸探针技术

在多种诊断伪狂犬病的方法中，核酸探针技术是近年来迅速发展起来的一种新型分子生物学技术。它具有特异性良好﹑敏感性高等优点，广泛应用于PRV的诊断和检测中。利用生物素和地高辛标记的探针，Maes等从三叉神经节诊断出了PRV的DNA。2008年，刘志杰等制备了gE基因核酸探针，最低的检出量达到4 pg，与PCR检测结果一致，这些数据显示该核酸探针可用于PRV野毒感染的临床检测。

4.3 基因芯片技术

基因芯片技术是基于PCR技术和核酸杂交的原理，在载体（如玻片）上可同时检测多种目的基因。张焕容等首次构建了PRV-PPV-JEV检测的基因芯片，PRV、猪细小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）和流行性乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）检测的新技术，该基因芯片技术能够同步检测和鉴别PRV、PPV和JEV，同时也能够鉴别PRV的野毒株和基因缺失疫苗株。

4.4 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一种扩增DNA的快速新方法，简单、实用、经济是其主要的特点。根据PRV gE基因保守序列，杨睿等设计了4条引物，冻融处理血液病料后加入荧光染料SYBR Green，应用LAMP技术，40 min内即检测到了PRV的存在。并与标准阴性血清和猪圆环病毒血清均不反应。与PCR技术相比，LAMP简化了病料的前处理过程，从而缩短了检测时间，灵敏度更高，对病毒DNA的最低检测出质量浓度为6.2×10-9 mg/L，比普通PCR高出了100倍。根据PRV DBP基因上的一段序列，王树芬等设计并合成了3对LAMP引物，通过加入罗丹明B衍生物指示剂，建立了可视化的LAMP方法，可快速准确检测PRV。

PR的检测方法很多，各有其优缺点。传统方法操作较复杂或耗时较长，实际应用中有一定的困难；血清学方法，特别是鉴别ELISA试剂盒的研制成功和广泛应用，不仅使PRV的检测变得简便﹑快速﹑敏感，还可以鉴别野毒和疫苗毒；分子生物学方法具有灵敏度高﹑特异性好等特点，随着研究的深入和完善将会越来越被广泛应用。当然，无论哪一种诊断检测方法都不能彻底解决所有问题，可以根据检测目的和要求进行选择和配合应用，以期达到早发现﹑早解决。同时，还应不断深入研究，建立更多快速﹑簡便﹑实用的检测诊断方法，以更好地促进该病的综合防控和疫病净化工作的开展。