钙粘蛋白多肽修饰的透明质酸水凝胶诱导牙本质—牙髓再生的研究

黄健萍 王君 林思恩

[摘要] 該研究利用牙髓间充质干细胞具有往牙本质-牙髓组织分化的潜能，结合新型生物材料拟钙粘蛋白多肽修饰的透明质酸优越的生物学活性，综合运用细胞生物学和动物实验手段，探讨了此支架材料对人牙髓干细胞诱导为牙本质-牙髓组织的能力的影响。

[关键词] 间充质干细胞；牙再生；水凝胶；生物材料；组织工程

[中图分类号] R7 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2018）03（c）-0162-02

保留有功能的牙髓或者促进牙髓再生对于复杂牙髓疾病的治疗具有重要意义。随着对组织工程学和再生医学的深入研究，牙髓来源的干细胞与生物材料、诱导细胞生长或分化的相关因子进行复合为牙源性组织再生带来了新的希望。该研究充分利用牙髓间充质干细胞（DPSCs）多向分化的潜能，以钙粘蛋白多肽修饰的透明质酸（HA）水凝胶为载体，发挥 DPSCs 在牙本质-牙髓再生中的作用及新型生物材料HA的理想的组织相容性、生物降解性、良好的孔隙率和机械性能，为复杂牙髓疾病寻求新的治疗手段，具有良好的应用前景。

1 方法

1.1 制备钙粘蛋白多肽修饰的HA多孔水凝胶

配备1%透明质酸钠（74kDa）溶液，加入94%甲基丙烯酸酐，调整pH至8.0，冰上反应24 h。以透析法将溶液中分子量大小为6～8 k的大分子单体进行纯化。将钙粘蛋白多肽（Ac-HAVDIGGGC）、乱序多肽（Scr， Ac-AGVGDHIGC）分别与亲和素结合分子RGD（Ac-HAVDI GGGC）相连接。随后与HA骨架在碱性磷酸盐缓冲液于37℃过夜。以上材料混合致孔剂（PMMA）可以在紫外照射下以I2959催化交联成2%水凝胶样多孔支架结构。

1.2 牙髓间充质干细胞（DPSCs）的分离

牙齿完整拔出后冲洗消毒，无菌条件取出牙髓，D-Hanks液反复冲洗，剪成小块，加入3 g/LⅠ型胶原酶和4 g/L dispase 消化1～1.5 h；直径70 μm尼龙筛过滤成单细胞悬液，500 g/min 离心5 min，将细胞以含15%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液重悬后接种于塑料培养瓶。细胞生长接近融合时常规传代，扩增培养，倒置显微镜观察细胞形态。

1.3 体外诱导条件水凝胶对DPSCs分化的影响

1.3.1 水凝胶对DPSCs成牙、成脂分化作用 制备钙粘蛋白水凝胶二维涂层种植DPSCs，体外以成牙、成脂肪培养液培养。其中成牙诱导液组分为H-DMEM培养液、10%胎牛血清、100 U/mL青链霉素、地塞米松1 nM、抗坏血酸50 μM和β-磷酸甘油20 mM，行茜素红或碱性磷酸酶（ALP）染色。成脂诱导液组分为H-DMEM培养液、10%胎牛血清、100 μ/mL青链霉素、地塞米松50 nM、异丁基甲基黄嘌吟0.5 mM、胰岛素10 μg/mL和吲哚美辛50 μM，诱导后行油红O染色。

1.3.2 水凝胶对DPSCs成神经分化影响 钙粘蛋白水凝胶二维涂层种植DPSCs，以含20%FBS及3 mmol/L巯基乙醇的DMEM培养液预诱导24 h，洗涤后换成二甲基亚砜（DMSO）和200 mmol/L丁化羟基苯甲醚（BHA）的DMEM培养液进行诱导。取培养48 h后行免疫荧光染色观察DPSCs成神经分化潜能，观察中间丝（Nestin）表达水平。

1.3.3 Real Time PCR检测水凝胶对DPSCs的成牙分化影响 成牙分化诱导7 d后，以Trizol提取总RNA。逆转录获得cDNA后，参照Takara一步法，检测Osterix（OSX）、I型胶原（Col 1a1）基因表达水平。

1.4 裸鼠体内条件下水凝胶复合DPSCs的成牙髓分化效果

按上述体外实验部分准备含钙粘蛋白、乱序多肽及对照组水凝胶包裹DPSCs，细胞密度为2×107/mL。在特制的模具内光交联成型。在苯巴比妥钠腹腔麻醉条件下，8周龄的裸鼠（n=12）背部皮下分别种植含有钙粘蛋白多肽的水凝胶、乱序多肽修饰的水凝胶及对照组HA水凝胶。8周后，麻醉下处死裸鼠并取样冰冻切片后作茜素红和Von Kossa检测。

1.5 统计方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行分析。正态分布数据的组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），方差齐采用LSD检验。

2 结果

2.1 体外条件下水凝胶对DPSCs的成牙、成脂肪、成神经分化的影响

经成牙分化诱导液诱导后，钙粘蛋白多肽组ALP和茜素红染色均显著增强；经成神经诱导后，免疫荧光检测到钙粘蛋白多肽组中间丝（Nestin）的表达较其它两组显著增强，见图2。取RNA行RT-PCR分析提示，成骨分化指标OSX和Col1a1的表达量较对照组HA显著增强（均P<0.01），见图1。

2.2 裸鼠体内水凝胶对DPSCs成牙分化的影响

各组三维水凝胶经裸鼠体内种植8周后，经von Kossa染色和茜素红染色结果发现，在每组水凝胶内都有不同程度的钙沉积，以钙粘蛋白多肽组钙沉积量最为显著，见图2。

3 讨论

该研究探讨了体内和体外人牙髓干细胞在钙粘蛋白多肽修饰的HA水凝胶条件下的牙本质-牙髓再生能力，结果提示，钙粘蛋白多肽修饰的HA水凝胶可以作为牙髓间充质干细胞分化的理想支架，有助于牙本质-牙髓再生。

牙髓具有自我修复及再生能力，当牙髓组织受到外来刺激时，DPSCs 可迁移至牙髓暴露之处并取代退化的成牙本质细胞。DPSCs除了具有自我更新的能力之外，还具有多种分化潜能，包括成牙本质、成骨、成脂肪、成神经及成血管内皮的能力[1-2]。钙粘蛋白是存在于细胞膜的一种跨膜蛋白，被认为是牙和骨发育过程中细胞-细胞联接及间充质的紧密聚集的关键因子。有报道认为，如果将间充质干细胞（MSC）或者成骨细胞表面的 钙粘蛋白用特定的抗体进行封闭，MSC 及成骨细胞的成骨能力均会受到显著的抑制[3]。此外，还有研究报道钙粘蛋白基因变异会导致骨髓来源 MSC 成骨功能受损，造成骨发育迟缓，并趋向成脂分化[4]。该研究中生物材料的原料透明质酸HA来源于自然资源提取物，与其他材料相比，HA 不仅在生物相容性和促进细胞增殖方面具有优势，而且其可控的物理机械性能及促进成骨分化特性使其在牙本质-牙髓再生组织工程领域具有很好的应用前景。

[参考文献]

[1] Francisco-Javier Rodríguez-Lozano， Carmen-Luisa Insausti， Francisca Iniesta， et al. Mesenchymal dental stem cells in regenerative dentistr[J].Med Oral Patol Oral Cir Bucal，2012，17（6）：e1062-1067.

[2] Yang X， van den Dolder J， Walboomers XF， et al.The odontogenic potential of STRO-1 sorted rat dental pulp stem cells in vitro[J].J Tissue Eng Regen Med，2007，1（1）：66-73.

[3] Castro CH， Shin CS， Stains JP， et al. Targeted expression of a dominant-negative N-cadherin in vivo delays peak bone mass and increases adipogenesis[J].J Cell Sci，2004，117（Pt 13）：2853-2864.

[4] Di Benedetto A， Watkins M， Grimston S， et al. N-cadherin and cadherin 11 modulate postnatal bone growth and osteoblast differentiation by distinct mechanisms[J].J Cell Sci，2010，123（Pt 15）：2640-2648.

（收稿日期：2017-12-20）