肿节风炭疽病拮抗细菌的筛选与鉴定

宋利沙 蒋妮 缪剑华

摘要 为筛选出对肿节风炭疽病菌Colletotrichum dematium具有拮抗作用的细菌，开发新型生物制剂，本试验分别采用组织分离法和稀释平板法，从广西药用植物园科研基地健康肿节风植株的不同组织和根系土壤分离、纯化获得49株细菌。平板对峙试验结果表明，来自土壤的zjt-9、zjt-4，来自根系的zgs21及叶片的zyy13对肿节风炭疽病菌具有较强的拮抗作用，其中作用最强的是zjt-9。抗菌谱测定结果表明， zjt-9、zjt-4和 zyy13对供试的18种病原真菌均有明显的拮抗效果，拮抗作用最强的是zjt-9，平均抑菌宽度最高达19.10 mm；经显微镜观察，拮抗细菌可造成肿节风炭疽病病原菌菌丝膨大、畸形、断裂。通过形态学特性和16S rDNA鉴定，zjt-9菌株为甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus。

关键词 肿节风； 炭疽病； 拮抗细菌； 筛选； 鉴定

中图分类号： S 476

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018061

Abstract In order to develop new biocontrol agents with stable antagonistic effect onColletotrichum dematiumofSarcandra glabra， a total of 49 strains of bacteria were isolated from different tissues of healthy plants and soils in the Guangxi Medicinal Botanical Garden Research Base by dilution method and tissue isolation tests. The results of plate confrontation test showed that zjt-9， zjt-4， zgs21 and zyy13 had antagonistic effect on the anthracnose ofS. glabra； one strain of bacterium with promising antagonistic activity was obtained， which was strain zjt-9. Strains of zjt-9 and zjt-4 were isolated from soil， strains of zgs21 and zyy13 were isolated from plant roots and seedling leaves； antibacterial spectrum tests showed that it had significantly antagonistic activities to 18 plant pathogens， and zjt-9 had the strongest antagonistic activity with an antagonism width of 19.10 mm. When observed under the microscope， the mycelia ofC. dematiumwere swollen， abnormal and cracked. Based on morphological and 16S rDNA sequence analysis， strain zjt-9 was identified asBacillus methylotrophicus.

Key words Sarcandra glabra； anthracnose； antagonistic bacterium； screening； identification

肿节风为金粟兰科草珊瑚属多年生草本植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.） 的干燥全草，又名九节茶、接骨金粟兰等，主要分布于我国华南、 华东、西南各省区，在朝鲜、日本、东南亚和印度也有分布[1]。其具有清热凉血、活血消斑、祛风通络等功效，用于治疗血热紫斑、紫癜，风湿痹痛，跌打损伤等症，是中国药典的收录品种[2]，还是广西重要的传统瑶药品种“七十二风”中重要的风药品种之一[3]。现代药理和毒理研究表明，肿节风还具有抗菌消炎、抑制流感病毒、抗肿瘤和促进骨折愈合及镇痛等多种活性，急性毒性试验结果显示其无毒，具有较好的安全性[4]。以肿节风为主要原料的制剂有草珊瑚含片、肿节风片、肿节风注射液、血康口服液等[5]。肿节风在广西靖西、融安、东兰等县大面积种植过程中，出现了一种由半知菌类炭疽属黑线炭疽菌Colletotrichum dematium引起的严重的叶部病害，前期调查发现该病害平均发生率达50%以上，特别在融安的林下套种模式，发病率高達65%[6]，开展肿节风病害的研究和防治具有重要意义。

以化学药剂防治肿节风炭疽病[7]可能导致病原菌产生抗药性和耐药性，病害易复发，以及农药残留等问题。利用生防菌防治植物病害，因其具有对环境安全的优点，已经成为防治植物病害的重要方法之一，是目前国内外研究热点，也是未来绿色中药材发展的趋势。植物内生细菌可分布于植物不同组织中，靠植物提供营养物质，受植物组织的保护，不受外部环境的影响，具有稳定的生态环境。因此，内生细菌相对于附生细菌更易发挥生防作用，其防病机理主要表现有产生抗生素类、水解酶类、植物生长调节剂和生物碱类物质，或与病原菌竞争营养物质或空间，增强宿主植物的抵抗力以及诱导植物产生系统抗性等途径抑制病原菌生长[8-9]。植物内生细菌是植物病害防治的潜在生防资源菌，国内外已有很多报道[9-12]。应用拮抗微生物防治肿节风炭疽病，目前在国内外尚未见报道，本研究拟从健康的肿节风植株的不同组织和根系土壤中分离筛选，找出能有效控制此病害的生防细菌，以期为肿节风炭疽病的生物防治提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病原菌：肿节风炭疽病菌為黑线炭疽菌Colletotrichum dematium，编号Z1，由本实验室分离鉴定保存。供试18种病原菌，即稻胡麻斑病菌Bipolaris oryzae、三七灰霉病菌Botrytis sp.、三七根腐病菌Fusarium solani、香蕉煤纹病菌Helminthosporium torulosum、烟草黑胫病菌Phytophthora parasitica、豆蔻叶斑病菌Phyllosticta sp.、香蕉叶斑病菌Alternaria sp.、西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum、苦玄参叶斑病菌Alternariasp.、香蕉炭疽病菌Colletotrichumsp.、烟草立枯病菌Rhizoctonia solani、香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum、三七黑斑病菌Alternaria panax、广西莪术叶斑病菌Phomopsis sp.、烟草灰霉病菌Botrytis cinerea、香蕉煤纹病菌Helminthosporium torulosum、三七炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、艾纳香褐斑病菌Phoma sp.，均是本植物病理研究室保存的菌株。

样品来源：在广西药用植物园科研基地，采集肿节风不同种植区三年生和幼苗健康植株以及其根系土壤，分别从东、西、南、北4个方位采集健康植株各5株（包括根、茎、叶）以及其根系土壤，共372个样品，编号封存于保鲜袋中，带回实验室进行细菌的分离。

供试培养基：PDA 培养基（用于植物病原真菌培养及菌株拮抗效果测定）：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂15.0～20.0 g，蒸馏水1 000 mL；NA培养基（用于拮抗细菌分离纯化培养）：蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，琼脂 15.0～20.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.2 试验方法

1.2.1 内生细菌的分离、纯化和保存

采用组织分离法，即将健康的肿节风的根、茎、叶片用75%乙醇、无菌水擦拭干净，晾干，加入 10 mL无菌水和少量石英砂研磨成匀浆制成 10-1 浓度的原液，用移液枪吸取1 mL上层液体到装有9 mL无菌水的试管中，振荡均匀得到10-2 浓度。按此方法再将液体稀释到 10-3，10-4，10-5、10-6浓度备用。分别吸取不同浓度的液体 0.1 mL 均匀涂布到NA培养基上，每处理重复3 次。将涂布好的平板放入恒温培养箱，28℃培养48 h。根据菌落形态、颜色、透明度、边缘整齐度、干湿等特征，挑取不同性状的细菌菌落在NA平板上划线纯化、编号。将纯化好的细菌在4℃冰箱保存备用。

1.2.2 根系土壤细菌的分离

称取肿节风的新鲜根际土样10.0 g放入装有90 mL无菌水广口瓶中，摇床振荡20 min，制成土壤悬液（10-1）。从中取1 mL 土壤悬液注入盛有9 mL无菌水的试管中，振荡混匀（10-2）。依此类推制成10-3、10-4、10-5、10-6和10-7各种稀释度的土壤溶液备用。分别吸取上述不同稀释度的土壤溶液0.1 mL至准备好的NA平板上，均匀涂布，每处理重复3次。放置28℃恒温培养，48 h后记录，然后根据菌落形态、颜色、透明度、边缘、干湿等特征，挑取性状不同的菌落，在NA平板上进行划线纯化、编号、培养，在4℃保存备用[14-15]。

1.2.3 拮抗菌的筛选

采用平板对峙法[16-17]初筛，在PDA平板离边缘2 cm处接直径5 mm的供试病原菌菌块，在距菌3 cm处接种土壤中已分离纯化的细菌菌株，以只接种病原菌菌块为对照。每组设置3个重复，在28℃恒温培养，7 d后观测抑菌圈大小，筛选出对肿节风病菌有抑制作用的拮抗细菌。复筛与初筛方法一样。

1.2.4 拮抗细菌抗菌谱的测定

采用平板对峙法，在离病原菌菌块3 cm处接种待测拮抗细菌，以中央接病原菌作对照，不同处理的病原菌放在离平皿边缘2 cm处；28℃恒温培养6 d。每处理3次重复。测量病原菌菌落直径和抑菌带宽度。

1.2.5 拮抗菌株的鉴定

1.2.5.1 形态鉴定

拮抗细菌经无菌水稀释适当浓度后，接种于NA培养基上，于28℃恒温培养2～3 d，长出单菌落后，观察记录菌落形态[18]。同时，对菌体进行革兰氏染色，显微镜下观察其菌体形态以及大小。

1.2.5.2 分子生物学鉴定

将培养3 d的拮抗菌株接种到40 mL NB培养液的三角瓶（100 mL）中， 于28℃、180 r/min，恒温振荡培养48 h后制成菌体悬浮液，离心收集菌体，采用改良的SDS裂解法用DNA提取试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取细菌基因组DNA。采用细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对提取的DNA进行PCR扩增，由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。扩增反应在25 μL反应体系中进行，模板DNA （20～50 ng/μL） 0.5 μL，10×Buffer （含 Mg2+） 2.5 μL，dNTPs （各2.5 mmol/L） 1 μL，酶0.2 μL，引物各0.5 μL，加ddH2O至25 μL。热循环反应程序设置如下：94℃预变性4 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，30个循环；最后在72℃下修复延伸10 min。扩增中以水代替DNA模板为空白对照。用凝胶电泳法检测PCR反应结果，吸取4 μL PCR产物加入1%（W/V）琼脂糖凝胶，凝胶置于1×TBE缓冲液（0.9 mol/L Tris-Borate， 0.01 mol/L EDTA， pH=8.3）中，在110 V下电泳40 min。将扩增后的 DNA 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行纯化测序。并且把测序结果与GenBank中的序列进行BLAST比对。以16S rDNA相似序列，利用MEGA 4.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.2.6 病原菌菌丝显微镜观察

把菌落直接放置于倒置显微镜的载物台上，观察处理菌株和对照菌株菌丝体的形态变化，记录并拍照。

1.2.7 数据统计分析

资料统计结果用x±s表示，x是平均值，s为标准差，各组数据均采用SPSS19.0软件进行单因素ANOVA分析，选用LSD和Duncan氏检验法进行组间的多重比较分析，方差同质性检验，P<0.05为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的分离与筛选

从肿节风健康植株组织（根、茎、叶）和根系土壤中共分离得到49株细菌，其中，抑菌带<3 mm的有44株；在3～10 mm的有1株；抑菌带在13～19 mm之间有4株（表1）。zjt-9和zjt-4分离自肿节风根系土壤，zgs21和zyy13分别来自三年生根和幼苗的叶片。zjt-9、zjt-4、zgs21和zyy13对炭疽病菌的抑菌带宽度分别为18.50、16.00、15.25 mm和13.25 mm，其中抑菌带宽度最高的是zjt-9，最低的是zyy13（表1）。从健康肿节风的根系土壤分离得到的细菌的拮抗作用强于在其健康组织分离得到的内生细菌。

2.2 拮抗菌对肿节风炭疽病菌的抑制作用

内生细菌和病原菌在对峙培养中，两菌的菌落并未接触，而病原菌靠近内生菌的部分生长受阻。镜检结果显示，正常生长的植物病原菌的菌丝粗细均匀、粗壮、光滑，生长菌丝舒展（图2a）；对峙培养相向处的病原菌菌丝膨大、畸形、断裂（图2b～c）。

2.3 拮抗细菌抑菌谱

将拮抗细菌zjt-9、zjt-4、zgs21和zyy13对农作物和药用植物17种病原菌进行抑菌活性测定，平均抑菌带宽度从大到小依次是zjt-9>zjt-4>zyy13>zgs21（表2）。综上所述，拮抗细菌zjt-9、zyy13、zjt-4、zgs21对17种植物病原菌都有广谱性，zjt-9对稻胡麻斑病B.oryzae抑制作用较强，具有生防的应用前景。

2.4 拮抗菌株的鉴定

2.4.1 形态鉴定

菌株zjt-9在牛肉膏蛋白胨培养基上呈乳白色菌落，圆形或近圆形，表面湿润半透明，边缘整齐，无褶皱。菌体呈杆状，革兰氏染色呈阳性。

2.4.2 分子生物学鉴定

以 zjt-9基因组DNA为模板，用通用引物27F和1492R对16S rDNA序列进行PCR扩增，将获得的扩增产物进行测序，得到大小为1 448 bp的核苷酸序列，菌株登录号为MH259879。将该序列通过 BLAST程序与GenBank 中序列进行对比分析，结果显示菌株zjt-9与其比对的芽胞杆菌属同源，相似度高达99%，采用 MEGA 4.0 软件以GenBank中16S rDNA相似序列及相似率达99%的菌株16S rDNA序列构建系统进化树。结果（图3）表明，菌株zjt-9与多个B.methylotrophicus菌株序列在系统发育树同一个分支上，且此菌均为甲基营养型芽胞杆菌，综合菌株的形态学特征及分子生物学鉴定结果，拮抗菌株可初步鉴定为甲基营养型芽胞杆菌B.methylotrophicus。

3 结论与讨论

对广西肿节风主产区（靖西）的病害进行普查后发现，炭疽病是肿节风主要病害，发病時间长，发生普遍，造成中药材减产和品质下降，目前防治炭疽病主要采用化学药剂，即在病害发生的时期，交替使用甲基硫菌灵和多菌灵等药剂[7]。但是，长期施用化学农药，不仅给生态环境带来一系列的负面影响，且易导致病原菌产生抗药性和耐药性，造成病害复发。

甲基营养型芽胞杆菌B.methylotrophicus具有抗菌防病的功能，且具有抑菌广谱性，对开发生物农药和制剂具有潜在的应用价值。蔡丽等[19]从凤凰单丛茶筛选出具有抑菌活性的甲基营养型芽胞杆菌，对梨果黑斑病菌、核桃叶枯病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核菌的菌丝具有强的抑制作用，而对瓜果腐霉的菌丝抑制率很低。武利勤等[20] 从霍山石斛中分离出抑菌强的菌株RA，对石斛黑斑病菌的抑菌率达到70%，并对其他8种病原真菌具有较强的抑制效果，包括梨轮纹病菌、棉花黄萎病菌、白菜黑斑病菌、灰霉病菌、禾谷镰孢菌、稻瘟病菌，其中RA对棉花黄萎病菌和禾谷镰孢菌抑制效果最显著，抑菌率分别为80.1%和86.9%，菌株RA对辣椒立枯病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌能力稍弱，抑菌率分别为54.8%和63.6%。本试验首次发现甲基营养型芽胞杆菌对肿节风炭疽病菌的拮抗作用且对17种供试病原菌均具较强的拮抗效果，包括香蕉、水稻、烟草、西瓜等9种农作物病原真菌以及三七、艾纳香、豆蔻、广西莪术、苦玄参等9种药用植物的病原真菌，由于肿节风炭疽病病害严重，因此，筛选出具有良好效果的生防菌株对肿节风产业发展具有重要意义。本研究在实验室条件下测定了分离筛选到的甲基营养型芽胞杆菌对病原菌的拮抗作用，其在田间的效果如何尚属未知。另外其对肿节风生长有无促进作用，如何开发为生物农药及其使用方法等，有待进一步研究。

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（责任编辑：田 喆）