金龟子绿僵菌在草原羊草和克氏针茅根际的种群动态和根内宿存鉴定

蔡霓 王峰 农向群

摘要 绿僵菌防治草原蝗虫效果显著，其在草原田间的存活能力影响其持续控害效果。除了侵染昆虫，绿僵菌还具有在植物根际宿存和根内生的生活方式，但相关宿存规律和内生性的研究报道很少。本文研究了绿僵菌在内蒙古草原两种优势种植物羊草和克氏针茅根际的种群数量变化并对其在这两种草的根内宿存进行了鑒定。结果表明，在干旱的内蒙古草原，绿僵菌施用后种群数量在30 d内快速下降，但能够以低密度在羊草、克氏针茅根际土壤中至少延续宿存75 d，羊草根际环境比较利于绿僵菌生存。对菌株egfp基因标记的特异PCR检测证明了绿僵菌在羊草和克氏针茅根内宿存。试验数据为指导植保生物防治中充分利用绿僵菌的昆虫病原性和植物内生特性提供理论基础，也将成为绿僵菌物种生活方式多样性、与植物互作及共进化研究的重要基础。

关键词 金龟子绿僵菌； 根际宿存； 植物内生性； PCR检测； 牧草

中图分类号： S 476

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018309

Abstract The application ofMetarhizium for grasshopper control has been obtained significant effect in prairie. The survivability of the appliedMetarhizium is related to its sustained control effect in the grassland. In addition to infecting insects， the fungusMetarhizium also has rhizosphere competent and endophytic lifestyle interacting with plants. However， there are few reports on the fungal persistence and endogeneity. In this paper， we studied the population dynamics and endophyticity ofM. anisopliae in the rhizosphere of two dominant plants，Leymus chinensisandStipa krylovii in Inner Mongolia grassland. The results showed that the fungal population decreased rapidly within 30 days， but it could persist at least 75 days in the rhizosphere soil of the two grass species. The rhizosphere ofL. chinensis was more conducive to the funguss survival. The endophyticMetarhizium in the grass roots was identified by PCR detection of specificegfplabeling gene in the appliedMetarhizium isolate. The experimental data provided a theoretical basis for making full use of the entomopathogenic and endophytic characteristics ofMetarhizium in plant protection. They would also become important foundation for further study on the diversity ofMetarhizium lifestyles， their interaction and co-evolution with plants.

Key words Metarhizium anisopliae； surviving in rhizosphere； endophyte； PCR detection； pasture

近年，昆虫病原真菌的田间宿存及其与植物互作关系逐渐成为研究热点。绿僵菌属Metarhizium真菌是具有代表性的一类重要昆虫病原真菌，其寄主包括8目200多种昆虫和螨类，被研究作为害虫生物防治剂，用于农、林、草地虫害的防控[1-2]。在草原上，应用绿僵菌防治蝗虫取得令人瞩目的成效[3-5]。研究发现，施用的绿僵菌在田间土壤中有一定的腐生存活能力，从而保持较长的控害效果，马铃薯、花生等作物的根际环境有利于绿僵菌的宿存和增殖[6-8]。还有研究报道，一些绿僵菌种类或菌株对植物起到显著的促生长作用。例如，绿僵菌处理番茄Lycopersicon esculentum后，植株株高、根长、侧根数量和根干重都比对照明显增加[9]。对柳枝稷Panicum virgatum、扁豆Phaseolus vulgaris、玉米Zea mays和花生Arachis hypogaea的研究也发现了绿僵菌促进植株生长的作用[10-12]，

研究者认为绿僵菌与植物存在根际互作和内共生关系。然而，目前报道的绿僵菌宿主植物种类并不多，直接表明绿僵菌的植物内生性实验证据也很有限。Behie & Bidochka利用同位素15N跟踪，证明了在昆虫与植物（扁豆和柳枝稷）不接触而罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii存在的情形下，昆虫的有机氮被转移到植物体内，认为是昆虫病原绿僵菌通过植物内生作用将昆虫15N携带传送给植物[13]。后来，他们又以绿色荧光蛋白（GFP）标记的罗伯茨绿僵菌菌株接种扁豆，60 d后取根研磨并接种到选择性培养基上，获得了荧光菌落，以此证明了绿僵菌在植物根际定殖和内生性[14]。

我们长期应用绿僵菌防控草原蝗虫，已取得良好防治效果，一些防控区域的虫口密度持续控制在经济阈值以下[5，15]。为了研究应用的绿僵菌在草原田间的存活动态和植物内生性，我们构建了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记菌株，并将其用于内蒙古锡林浩特草原，以两种优势种牧草即羊草Leymus chinensis和克氏针茅Stipa krylovii进行试验，以期了解绿僵菌在草原田间环境下的存活能力和种群动态。研究数据和结果将为充分利用绿僵菌的昆虫病原性和植物内生性，提高生物防治作用提供理论指导，也将成为绿僵菌物种生活方式多样性、与植物互作及共进化研究的重要基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和分生孢子培养

金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae G-58为本实验室构建的携带增强型绿色荧光蛋白基因egfp的工程菌株。将菌株接种在添加0.5%酵母浸出粉的马铃薯葡萄糖琼脂（PDAY）平板上，在26℃下避光培养14 d，收集分生孢子，贮存于4℃备用。

1.2 供试植物

供试植物为内蒙古锡林浩特（东经113°45′～114°21′、北纬42°15′～42°35′）田间多年生天然羊草Leymus chinensis和克氏针茅Stipa krylovii，沙质土壤，肥力贫瘠。

1.3 绿僵菌接种植物处理和采样

用灭菌的0.1%Tween-80水溶液配制绿僵菌G-58的分生孢子悬浮液。在显微镜下用血细胞计数器计数，得到浓度为1.35×107个/mL的孢子悬浮液。

在草原田间，分别选择羊草和克氏针茅为单一优势种且植株长势均匀地块，扎下木桩标记样方，每样方1 m×1 m，内含不少于30株植物。用打孔器在每株四周“十”字对称打4个孔，孔距离植株2～3 cm、深10 cm。用注射器向每孔注入10 mL菌液（图1）。每处理重复3个样方，对照样方注入清水。

处理当日和之后7、15、30、45、60 和75 d取样。每次随机取样3株，用铲子连根铲出植株，连同泥沙带回实验室。轻轻抖动植株，去除外围泥沙后，用毛笔小心清扫根表，收集根际土壤，保存于4℃，用于检测土壤含菌量。另外，剪去植株地上茎叶部分，保留根系，用自来水和灭菌蒸馏水各漂洗2次，在超声波清洗器（上海志信仪器有限公司，DL-120-B型）上清洗10 min（参考刘淑梅等[16]），再用灭菌蒸馏水漂洗2次，置于在吸水纸上自然晾干15 min。每个根分成两份，一份在-80℃下保存，備用于PCR检测，另一份保存于4℃，2 d内进行内生菌分离。

1.4 根际土壤中绿僵菌存活数量检测

从每份根际土样各称取1.000 g，加灭菌的0.1%吐温80水溶液9 mL，在旋涡振荡器上振荡30 s，2次，按1∶3稀释1次，得到稀释40倍的土壤悬浮液。从悬浮液中部吸取200 μL接种到选择性培养基（1 000 mL PDAY中加氯霉素160 mg和放线菌酮80 mg）上，每个土样重复接种5皿，涂布均匀。置于26℃培养5 d，观察记录菌落数。同时称量土样（精确至0.001 g）置于120℃烘烤120 min，检测含水量。最终以菌落形成单位数cfus （colony forming units）即每g 干土壤的菌落数进行评估。

菌落形成单位数cfus=稀释倍数×平皿菌落数/（1-含水量）。

1.5 根内绿僵菌egfp标记PCR检测

1.5.1 DNA提取

接种试验菌株G-58于液体培养基（蔗糖3%，蛋白胨1%）中，26℃ 180 r/min摇床培养60 h。用真菌DNA提取试剂盒（Genemark Biotech. Co.，Ltd）提取菌丝体DNA。羊草和克氏针茅根样品用植物基因组DNA纯化试剂盒（Genemark Biotech. Co.，Ltd）提取DNA。每份根样品提取3份重复。提取的DNA样品用分光光度计（IMPLEN公司NanoPhotmeter）测定浓度。

1.5.2 PCR条件和灵敏度

尽管PCR对特定的DNA模板敏感，但考虑到根中绿僵菌内生量很低，大量的植物DNA可能会干扰引物靶向，因此，必须优化PCR条件和提前检测反应灵敏度。根据供试菌株的egfp特定标记设计了引物扩增，经检测和优化，得到引物对为Pg-F（5′-AGTCAGTCTCCCTTG CGGTT）和Pg-R （5′-TGGGTGCTCAGGTAGTGGTT）。设置1∶500，1∶1 000， 1∶1 500，1∶2 000，1∶2 500，1∶3 000，1∶3 500和1∶4 000系列比例的绿僵菌与羊草或克氏针茅的混合DNA模板。优化的PCR体系为50 μL，其中包括5 μL 10×Ex Taq缓冲液，4 μL 2.5 mmol/L dNTP混合物，2 μL各10 μmol/L正反向引物，0.25 μL 5 U/μLEx Taq和1 μL DNA模板。优化后的PCR反应程序为： 95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min， 40个循环；最后72℃延伸10 min，保持在4℃。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离。

1.5.3 根样品egfp标记的特异性PCR检测

采用上述优化的PCR条件，检测处理各采样日的所有羊草和克氏针茅样品，包括每个采样日的3个植株根样品的各3次重复提取的DNA。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离。有阳性扩增片段的则确定为存在内生的绿僵菌。

1.6 根内生绿僵菌的分离培养鉴定

分离培养基（CAD）为1 000 mL PDAY中加氯霉素 160 mg、放线菌酮 80 mg和多果定20 mg。将上述 1.3 洗净的根样剪碎并略加研磨，涂布在 CAD平板上，26℃培养 5 d，将疑似菌落转移到新PDAY平板上，再培养 10 d。通过菌落形态和显微形态鉴定为绿僵菌后，再置于激光扫描共聚焦显微镜（LSCM） 488 nm波长下观察，如果菌丝或孢子具有绿色荧光则判断为供试绿僵菌。

2 结果与分析

2.1 绿僵菌在根际存活的种群动态

通过选择性培养基分离检测土样，得到施菌处理后75 d内，绿僵菌在根际土壤中内的存活数量动态（图2），表明在干旱的内蒙古草原，绿僵菌施用后种群数量快速下降，7、15和30 d时，在羊草根际分别下降至72.3%、26.4%和20.3%，在克氏针茅根际分别下降至18.8%、6.7%和5.8%； 之后继续下降，但下降速率减缓，至75 d还有低密度种群延续宿存。相对地，羊草根际环境比克氏针茅更利于绿僵菌维持种群生存。

2.2 绿僵菌在根内宿存的分子标记鉴定

2.2.1 PCR检测根中绿僵菌egfp标记的灵敏性

在优化的条件下，以1∶500～1∶4 000 之间8个比例的绿僵菌与羊草或克氏针茅混合DNA模板进行了PCR检测，结果显示，混合比低至1∶3 000的绿僵菌与羊草混合DNA和1∶3 500的绿僵菌与克氏针茅混合DNA都能够被有效扩增，得到特异性egfp片段（图3），说明优化的PCR可以高灵敏地鉴定出宿存于羊草或克氏针茅根中的绿僵菌。

2.2.2 羊草、克氏针茅根内生绿僵菌的PCR鉴定

对接种处理后不同时期的羊草、克氏针茅根样本进行了PCR检测，结果显示，在羊草第7天、第15天的根和克氏针茅中第15天、第30天和第75天的根中扩增得到了egfp标记片段；但是并非3个重复植株全都能够扩增得到预期片段（图4）。因此可以确定施用的绿僵菌在约15 d后进入了羊草和克氏针茅根内，但其宿存丰度较低且可能分布不均，导致有时根样DNA的PCR不能检测到egfp标记片段。

2.3 绿僵菌在根内宿存的分离鉴定

在CAD分离培养基上，从处理的根培养得到形态类似绿僵菌的菌落，转移到新PDAY上纯化培养，经显微形态鉴定表明，从30、45 d和75 d根样分离的菌落具有金龟子绿僵菌特征，进一步通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察，可见菌丝和孢子具有绿色荧光（图5），即证明了绿僵菌的根内宿存。

3 讨论

现有的研究文献多关注绿僵菌对昆虫的致病作用，而对其与植物的关系和相互影响知之甚少。实际上，绿僵菌除了昆虫致病性外，兼性腐生和植物内生特性在植物保护中发挥着重要作用，应当受到重视。

不同营养方式赋予了绿僵菌适应不同环境的生存能力，包括侵染昆虫实现种群大量增殖，利用土壤腐殖质、植物根际游离碳延续种群，甚至进入植物组织内部获取生存机会。研究证明，昆虫病原真菌能够利用植物根际游离碳，并通过与根相互作用获得生存和生长利益。例如，将绿僵菌施用到甘蓝田间6个月后，在甘蓝根际土壤（rhizosphere soil）中的存活数量比在根围土壤（bulk soil）中高100倍，保持初始施菌105水平，认为根际因子对绿僵菌持续存活有促进作用[17]。还有试验证明，绿僵菌施用1年后在欧洲云杉Picea abies根际的存活比在根围存活更好[18]。绿僵菌在花生播种时施用后，其种群在根际与在远离根土壤中的动态变化完全不同。虽然在90 d内种群都下降至10%左右，然而120 d后，根际种群出现回升，达到初始接种量的50%～60%。作者分析认为是由于花生经历了较长时间发育，根代谢物分泌到根际环境，利于绿僵菌种群的重建[8]。因为花生如同一般植物，将从光合作用获得的10%～40%的碳转移到土壤中，形成分泌物、黏液、剥落的细胞和溶液[19-20]。根际环境可能是绿僵菌等昆虫病原真菌离开昆虫寄主后保持种群的重要庇护所，种群的延续是田间长期控制害虫的必要前提。本试验中，绿僵菌施用于干旱草原上，30 d内也出现快速下降，然后降速减缓，至75 d时羊草和克氏针茅根际仍宿存有低密度种群，但未出现种群回升。根际种群能否继续存活或增殖重建可能与植物发育代谢相关，还与温湿度相关。在草原试验区，气候干热，沙地持水力差，试验期间监测的土壤湿度日均都在5%以下，羊草和克氏针茅正常生长但不旺盛，这些条件可能不足以促进根际绿僵菌种群的重建。

近年发现绿僵菌植物内生性并引起关注，但当前研究仍然较少，尚未揭示其相互作用机制。检测证明绿僵菌与宿主植物内生关系是相关研究的重要基础。从当前的研究看，仅报道了少数宿主植物种类的生长促进作用，更少报道绿僵菌植物内生性的直接证明。Sasan等以绿色荧光蛋白（GFP）标记的罗伯茨绿僵菌菌株接种柳枝稷，却只在用乳酸苯酚-棉蓝染色的接种60 d后的根组织纵切片中观察到皮层细胞间隙内存在菌丝体，没有切片观察的荧光菌丝[10]。Behie等也以绿色荧光蛋白（GFP）标记的罗伯茨绿僵菌菌株接种扁豆，60 d后取根研磨并接种到选择性培养基上，获得了荧光菌落，以此证明了绿僵菌的植物定植和内生性[14]。可见，绿僵菌在植物中宿存几率或宿存量可能很小，不像观察植物病原菌和专性共生菌那样可直接观察和捕捉到内生证据。分子生物学方法，如特异基因标记片段的PCR，可能在检测绿僵菌植物内生性中具有高灵敏优势。本试验中，我们以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的绿僵菌接种羊草和克氏针茅，对不同采样时间的根样也通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）进行了观察，但很遗憾没有观察到根组织中有清晰的荧光菌丝或孢子。然而，通过对egfp特异标记片段的PCR，在几个时间段采集的样本中都证明了施用的绿僵菌存在于羊草和克氏针茅根中。从系列比例混合的绿僵菌-根DNA模板试验证明PCR检测灵敏度可达到1∶3 000，可作为低量宿存菌的快速高效检测方法。

绿僵菌与昆虫、植物在相同栖境中长期共存，它们形成了复杂的相互关系，演变出不同的生态功能以彼此相适应。本研究支持绿僵菌物种的多功能生活方式，对研究植物与真菌之间的相互作用和共同進化具有重要意义。因此需要进一步研究绿僵菌在田间种群动态变化规律和绿僵菌内生的形成机制及其生物学意义，评估绿僵菌的多重生态功能在植物保护实践中的潜力。

参考文献

[1] SKINNER M， PARKER B L， KIM J S.Role of entomopathogenic fungi in integrated pest management [M]∥ABROL D P， SHANKAR U. Integrated pest management. Wallingford， UK： CABI Publishing， 2014： 169-191.

[2] 张礼生，张泽华，高松，等.绿僵菌生物农药的研制与应用[J].中国生物防治，2006，22（S1）：141-146.

[3] BATEMAN R， JENKINS N， KOOYMAN C， et al. The development of an acridid-specific mycoinsecticide [M]∥LACE L A.Microbial Control of Insect & Mite Pests，chap.23 LUBILOSA，2017：343-353.

[4] 孙涛，龙瑞军.我国草原蝗虫生物防治技术及研究进展[J].中国草地学报，2008，30（3）：88-93.

[5] 张泽华，高松，张刚应，等.应用绿僵菌油剂防治内蒙草原蝗虫的效果[J].中国生物防治，2000，16（2）：49-52.

[6] PAULITZ T C. Population dynamics of biocontrol agents and pathogens in soils and rhizospheres[J]. European Journal of Plant Pathology， 2000， 106：401-413.

[7] 陈斌，邓裕亮，李正跃，等.绿僵菌对小云斑鳃金龟毒力及在土壤中的宿存[J].西南农业大学学报，2004，26（5）：580-583，593.

[8] LIU Xun， NONG Xiangqun， WANG Qinglei， et al. Persistence and proliferation of a ChineseMetarhizium anisopliae s.s. isolate in the peanut plant root zone [J]. Biocontrol Science and Technology， 2016， 26（6）： 746-758.

[9] ELENA G， BEATRIZ P， ALEJANDRO P， et al.Metarhizium anisopliae（Metschnikoff） Sorokin promotes growth and has endophytic activity in tomato plants [J]. Advances in Biological Research， 2011， 5（1）： 22-27.

[10]SASAN R K， BIDOCHKA M J. The insect-pathogenic fungus Metarhizium robertsii （Clavicipitaceae） is also an endophyte that stimulates plant root development[J]. American Journal of Botany， 2012， 99（1）： 101-107.

[11]KABALUK J T， ERICSSON J D. Seed treatment increases yield of field corn when applied for wireworm control [J]. Agronomy Journal， 2007， 99： 1377-1381.

[12]LIU Shaofang， WANG Guangjun， NONG Xiangqun， et al. EntomopathogenMetarhizium anisopliae promotes the early development of peanut root [J].Plant Protection Science，2017，53（1）：8-14.

[13]BEHIE S， BIDOCHKA M. Endophytic insect-parasitic fungi translocate nitrogen directly from insects to plants[J]. Science，2012， 336（6088）： 1576-1577.

[14]BEHIE S W， JONES S J， BIDOCHKA M J. Plant tissue localization of the endophytic insect pathogenic fungiMetarhizium and Beauveria [J].Fungal Ecology， 2015， 13： 112-119.

[15]王洁，涂雄兵，范要丽，等.绿僵菌在蝗虫种群中传播流行与其持续控制作用[J].草业与畜牧，2015（3）：34-41.

[16]刘淑梅，陈军.根类中草药净洗中引进超声波清洗技术的探讨[J].甘肃高师学报，2012，41（3）：167-168.

[17]HU Gang， ST LEGER R J. Field studies using a recombinant mycoinsecticide （Metarhizium anisopliae） reveal that it is rhizosphere competent [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2002， 68（12）： 6383-6387.

[18]BRUCK D J. Ecology ofMetarhizium anisopliae in soilless potting media and the rhizosphere： implications for pest management [J]. Biological Control， 2005， 32： 155-163.

[19]ANDREWS J H， HARRIS R F. The ecology and biogeography of microorganisms on plant surfaces [J]. Annual Review of Phytopathology， 2000， 38： 145-180.

[20]BARDGETT R D. The biology of soil： A community and ecosystem approach [M]. New York： Oxford University Press， 2005： 86-118.

（責任编辑：田 喆）