小菜蛾MAP4K4基因上游5′—侧翼序列克隆与结构分析

郭乐 郭兆将 康师 孙丹 周君雷 龚莉君 张友军

摘要 本实验室前期研究表明，小菜蛾通过有丝分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信号途径上游转录激活的关键基因MAP4K4反式调控多个中肠受体基因的表达，从而介导其对苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）产生的Cry1Ac杀虫蛋白的高抗性。为进一步明确MAP4K4基因转录激活而过量表达的顺式调控机制，本文利用小菜蛾基因组数据库中MAP4K4基因序列信息，首先克隆了Bt Cry1Ac敏感小菜蛾种群MAP4K4基因上游5′-侧翼序列，得到了两种不同形式的5′-侧翼序列：MAP4K4-1和MAP4K4-2。随后，预测分析了其中的潜在功能顺式作用元件，同时发现其中核苷酸的转换会导致顺式作用元件的改变。本研究初步揭示了小菜蛾MAP4K4 基因的5′-侧翼序列的遗传多样性，为后续明确MAP4K4的顺式调控机制奠定了基础。

关键词 小菜蛾； MAPK信号途径； MAP4K4； 5′-侧翼序列； 顺式调控机制

中图分类号： S 433.4

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017265

Abstract Our previous studies indicated that the crucial gene MAP4K4， a constitutive transcriptionally-activated upstream gene of MAPK signaling pathway， could trans-regulate the expression of multiple midgut receptor genes thereby mediating the high-level resistance to Bt Cry1Ac toxin in Plutella xylostella （L.）. In this study， to further clarify the cis-regulatory mechanism of transcriptional activation and overexpression of MAP4K4 gene， we utilized the genome database of P.xylostella and cloned the 5′-flanking sequence of MAP4K4 gene from Bt Cry1Ac-susceptible P.xylostella for the first time， and two isoforms including MAP4K4-1 and MAP4K4-2 were detected. Subsequently， the potential functional cis-acting elements in both MAP4K4-1 and MAP4K4-2 isoforms were predicted， and the results showed that the transformation between nucleotides could result in alterations of intrinsic cis-elements. This study revealed the genetic diversity of the 5′-flanking sequence of MAP4K4 gene in P.xylostella and lays a foundation for further exploration of the cis-regulatory mechanism of MAP4K4 gene in P.xylostella.

Key words Plutella xylostella； MAPK signaling pathway； MAP4K4； 5′-flanking sequence； cis-regulatory mechanism

小菜蛾Plutella xylostella （L.），屬于鳞翅目Lepidoptera菜蛾科 Plutellidae，是一种为害十字花科作物的世界性重大农业害虫，每年在世界范围内引起的经济损失高达40亿～50亿美元[1]。苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis （Bt）是一种革兰氏阳性土壤细菌，其在产孢阶段能产生多种杀虫晶体蛋白（又称δ-内毒素），从而能高效专一地杀死多种田间重要害虫且对人畜及环境安全无害。Bt制剂被认为是化学杀虫剂的优良替代品，目前，Bt制剂已成为世界上产量最大、用途最广的微生物杀虫剂[2]。1990年，首次报道了小菜蛾在田间对Bt喷洒制剂产生抗性[3]，随后，它成为研究害虫对Bt产生抗性的模式昆虫之一。前期研究表明，小菜蛾对Bt产生高抗性的分子机制主要是由于其中肠Bt毒素受体的变化（突变或表达量变化）影响其与Bt毒素的结合导致的[4]。

近期，Baxter等通过遗传图谱定位的方法研究发现位于小菜蛾BtR-1抗性基因座内的ABC转运蛋白基因ABCC2序列突变导致小菜蛾NO-QA种群对Bt Cry1Ac毒素产生高抗性[5]。研究发现，本实验室小菜蛾对Bt Cry1Ac毒素的高抗性与中肠CAD基因和ABC转运蛋白ABCH1基因无关[67]。本实验室小菜蛾与NO-QA种群具有相同的BtR-1抗性基因座，因此，利用小菜蛾基因组和家蚕基因组的序列信息和染色体共线性关系成功组装了小菜蛾约3.15 Mb的BtR-1抗性基因座，并通过一系列生化、分子生物学、遗传学和生物信息学等技术最终在国际上首次发现小菜蛾对Bt的高抗性是由位于BtR-1抗性基因座内的有丝分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信号途径上游恒定转录激活的关键基因MAP4K4反式调控BtR-1抗性基因座内外的ALP和ABC转运蛋白基因（ABCC2、ABCC3和ABCG1）表达下调导致的[89]。

1.3.4 MAP4K4基因5′-侧翼区序列差异性及顺式作用元件（cis-acting elements）预测及分析

利用Clustal Omega软件（http：∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）及GeneDoc 2.7进行多重序列差异性比较。将克隆成功的序列利用启动子转录起始位点分析网站BDGP（http：∥www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）进行转录起始位点预测，而后手动校正TATA box所在位置。利用顺式作用元件预测网站PROMO（http：∥alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi？dirDB=TF_8.3）和JASPAR（http：∥jaspar.genereg.net/）进行转录起始位点分析。

2 结果与分析

2.1 MAP4K4基因组信息

基于GenBank中小菜蛾基因组数据以及自写的Perl脚本信息，可知MAP4K4位于Scaffold NW_011952173.1上，基因编号为LOC105387010。MAP4K4的走向与邻近基因的走向相反。截取的5 000 bp位于MAP4K4及邻近基因之间，该片段除了涵盖全部MAP4K4的5′-侧翼区外，还包括了MAP4K4的部分近端编码区以及临近基因的小部分侧翼区，保证了截取5′-侧翼区的完整性（图1）。

2.2 小菜蛾基因组DNA的提取

用整头4龄小菜蛾幼虫提取基因组DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性，结果表明，提取的单头小菜蛾DNA浓度较高，部分样品（MS1～MS7）电泳结果见图2。用紫外分光光度计测定DNA的OD260/OD280比值均在1.8～2.0之间，表明所有模板均可用来MAP4K4基因5′-侧翼区的克隆。

2.3 引物筛选及MAP4K4的5′-侧翼区序列截短

设计的6对引物中，前5对均能克隆出包含目的片段的条带（图3a），连接转化后，菌液测序，结果表明，这些区域中存在高级结构而无法测通。引物P′能成功克隆出3 250 bp左右的片段（图3b），同样，用启动子预测网站进行分析，该区域已经包含了MAP4K4基因的整个5′启动子核心区、5′非翻译区（5′-UTR）以及近端编码区。

2.4 序列差异性分析

为了保证克隆结果的真实性，本试验以10头未区分雌雄的生长状况好的小菜蛾4龄初期或中期幼虫基因组DNA为模板，用引物P′-F/P′-R进行了大量的克隆及测序，得到了两种不同形式的目的片段：MAP4K4-1和MAP4K4-2，它们与基因组序列的相似度分别为97.04%、77.58%。随后又分别用1头4龄雌虫和1头4龄雄虫的基因组DNA为模板进行克隆，两个样本中均扩增出MAP4K4-2（表2）。测序结果表明，从未区分雌雄的10个样本中共得到50条MAP4K4序列，其中从5个样本中获得28条MAP4K4-1序列，从5个样本中获得22条MAP4K4-2序列。从雌雄样本中分别得到4条MAP4K4-2序列。MAP4K4-1和 MAP4K4-2分别占据总测序量的48.3%、51.7%。表明这两种形式的MAP4K4的 5′-侧翼区在试验小菜蛾种群中趋向于均匀分布，且与雌雄无关。

2.5 MAP4K4的5′-侧翼区顺式作用元件分析

MAP4K4-1及MAP4K4-2与基因组序列相互比较发现，后两者之间具有明显差异，MAP4K4-2中间插入了260 bp的长片段。经转录起始位点预测网站分析，三者的转录起始位点为同一个胸腺嘧啶T（图4）。TATA box位于转录起始位点上游48-38 bp，序列为TATAAATTAA。5′-UTR区长83 bp，说明长片段的插入未改变MAP4K4基因的转录起始位点。利用多重序列比较，对MAP4K4基因5′-侧翼的基因组数据24个位点进行了校正，分别为18个突变位点，5个缺失区以及1个插入位点（图4）。MAP4K4-1与基因组序列及MAP4K4-2相比，存在27个差异位点。MAP4K4-2与MAP4K4-1及基因组序列比较，除了1个大片段的插入之外，还存在21个差异位点。

MAP4K4-1及MAP4K4-2的顺式作用元件分析后，保留MAP4K4-2中与MAP4K4-1存在位点差异顺式作用元件。结果显示，在这些差异位点中，MAP4K4-1丢失了16个顺式作用元件，而MAP4K4-2引入了21個新的元件。其中在长片段插入区，引入的12个顺式作用元件中有5个为Mad元件（图4），该转录因子结合位点在该区域出现富集的现象。5′-UTR区没有位点变化。这表明，位点的突变、插入和缺失可能导致顺式作用元件的改变和丢失，同时也可能引入新的顺式作用元件，且一个位点的改变甚至能引入多个顺式作用元件。

3 讨论

MAPK信号途径是一个十分复杂而且庞大的调控网络。多年来，尽管MAPK信号途径在人类等哺乳动物中得以广泛研究，但是它目前仍是医学研究领域的热点及难点，而这一重要信号途径的上游关键基因MAP4K4在哺乳动物以及包括昆虫在内的无脊椎动物中研究甚少。研究表明，位于MAPK信号途径上游的MAP4K4基因在秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans和果蝇Drosophila spp.等物种中发挥着重要的生理功能[1618]。在Bt研究领域，MAPK信号途径已被证实参与了线虫和昆虫对Bt毒素的免疫防御反应调控[1923]。

研究发现，MAPK途径可以调控哺乳动物ALP[2426]以及人类ABCC基因表达量[23，2729]，而本实验室郭兆将等也首次研究发现MAPK信号途径可以调控小菜蛾中肠ALP和ABCC基因表达量从而导致小菜蛾对Bt产生高抗性，而这一调控过程中MAP4K4基因在Bt抗性小菜蛾中过量表达发挥了关键调控作用[6]。目前，基因调控研究主要集中在启动子区的顺式作用元件（cis-acting elements）及下游包括转录因子在内的反式作用元件（trans-acting elements）的研究。为进一步了解MAPK信号途径中MAP4K4基因在Bt敏感和抗性小菜蛾中的调控模式，本文对该基因的5′-侧翼区进行了解析。利用小菜蛾基因组数据库序列信息，克隆了Bt Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S的MAP4K4 基因5′-侧翼区序列，与基因组原始序列相比，得到了两种不同形式的侧翼区序列MAP4K4-1及MAP4K4-2，它们基因组序列的相似度分别为97.04%、77.58%，测序结果表明，两种形式的侧翼序列在试验种群中趋向均匀分布，且与雌雄无关。MAP4K4-1与基因组序列的差异主要集中在小位点的突变、插入和缺失，MAP4K4-2则主要为中间260 bp长片段的插入。此外，两种形式的序列与基因组数据比较后，对基因组MAP4K4 的5′-侧翼序列24个位点进行了校正。利用启动子预测及顺式作用元件预测软件对克隆的序列进行分析可知，一个位点的改变会引起原有顺式作用元件的消失，同时也可能引入一个或者多个新的顺式作用元件，而在MAP4K4-2插入的长片段中，则出现了Mad转录因子结合位点的富集。

目前，DNA侧翼序列的生物学功能，尤其是对基因的表达调控机制，是功能基因组学的研究热点。基因组中大量的DNA非编码序列都有某些特殊的功能[30]，非编码区中分布着许多功能元件，它们有些可作为顺式调节元件发挥作用[31]。基因5′-侧翼区核苷酸的突变引起顺式作用元件的变化，从而调控基因在同一物种或不同物种时空表达发生差异[32]。

Mad（max dimerization protein）属于碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix， bHLH）蛋白家族B亚族成员[33]。在小鼠中，该家族有4个成员，包括Mad1、Mxi1（max interactor 1）、Mad3和Mad4。它们均能与转录因子Max形成二聚体，阻遏细胞增殖循环[34]，或者阻止启动子中含有CACGTG位点的基因转录[35]。而线虫仅有1个Mad家族成员，即Mdl-1（mad like 1），它能与Max家族的Mxl-1形成二聚体，在线虫胚胎发育后期发挥着重要作用[36]。果蝇中未发现该家族成员[36]。目前在小菜蛾中未报道过Mad家族的作用机制及其功能。MAP4K4-2中长片段的插入中产生的多个Mad结合位点，是否同样参与了相关功能仍是未知的。同时，该基因中的转录因子结合位点在调控小菜蛾MAPK信号途径下游基因的表达中的作用也值得重视。

总之，本文基于本实验室前期MAPK4K4基因的研究基础，对小菜蛾MAP4K4发挥调控功能的5′-侧翼区进行了解析，明确了基因突变、插入和缺失引起的转录因子结合位点的改变情况，为进一步研究MAP4K4基因在小菜蛾Bt抗性种群中过量表达的顺式调控机制提供了良好的实驗基础，为研究昆虫顺式作用元件突变在进化过程中的作用提供借鉴，这也为全面理解MAPK信号途径在小菜蛾乃至其他昆虫的Bt抗性调控机制奠定了基础。

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（责任编辑：田 喆）