棉蚜唾液腺蛋白armet基因的克隆及表达特性分析

任柯昱 张帅 雒珺瑜 吕丽敏 崔金杰 祝建波

摘要 armet是一种水溶性唾液蛋白，在蚜虫取食过程中具有重要作用。本研究结合棉蚜的转录组分析结果，以注释的armet基因转录本作为参考，克隆得到棉蚜的armet基因（GenBank登录号KY612465）。armet基因的开放阅读框为522 bp，编码173个氨基酸。在其氨基酸序列的N端具有一个由21个氨基酸组成的信号肽。在其氨基酸序列的C-末端具有内质网滞留信号KDEL。运用RT-qPCR分析棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜的时间表达谱，结果表明，armet基因的表达量在除3日龄成蚜外的各个时期均稳定表达，在两种专化型棉蚜中表达量相当，说明armet基因可能在棉蚜整个生命活动过程中均起重要作用。分别将棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜转接到西葫芦Cucurbita pepo L.后，通过荧光定量PCR检测armet基因在转接寄主前后表达量的变化，结果显示armet基因在转接第2代3日龄黄瓜型成蚜中的表达量显著高于转接前，在其他转接试验中转接前后表达量有变化，但未达到显著水平，说明armet基因在不同专化型棉蚜寄主转接试验的成、若蚜中发挥不同作用。

关键词 棉蚜； 寄主专化型； armet； 寄主转移； 表达谱

中图分类号： S 433.39

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017062

Abstract ARMET is a water-soluble saliva protein thought to be crucial for Aphis feeding. In this study， the gene armet was cloned according to the annotated armet transcript sequence from the Aphis gossypii transcriptome （GenBank accession no. KY612465）. The open reading frame of armet was 522 bp， encoding 173 amino acids. It had a signal peptide sequence of 20 amino acid residues in N-terminal region. The C-terminus of its amino acid sequence had an ER retention signal that was KDEL. The temporal expression pattern of armet in aphids on Cucumis sativus and Gossypium hirsutum were studied by RT-qPCR analysis. The expression level of armet gene was stable in all stages except in 3-day-old aphids， and the expression level of armet gene in two biotypes of cotton aphids was similar， which indicated that armet gene might play an important role in the whole life of cotton aphid. The aphids were then transferred to Cucurbita pepo L. from C.sativus and G.hirsutum aphid and the expression of armet was detected by RT-qPCR. The results showed that the expression of armet gene in the 3-day-old aphids of the second generation on C.sativus was significantly higher than that before the transfer， but no significant differences were observed transferrin other transfer experiments， indicating that the armet gene played different roles in the host transfer process.

Key words Aphis gossypii； host biotype； armet； host transfer； gene expression profile

棉蚜Aphis gossypii属半翅目刺吸式口器昆虫，其生态适应性广，为多食性昆虫，在长期的进化过程中，已形成不同的寄主专化型。据研究报道，在世界上，棉蚜的寄主多达285种[1]。在中国，棉蚜主要分为黄瓜型棉蚜和棉花型棉蚜[23]，棉花型与黄瓜型的棉蚜相互转接后其存活率及繁殖力均明显下降且不能建立种群，棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜都能在西葫芦上建立种群[4]。西葫芦为棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜的重要中间寄主[5]。

棉蚜在与寄主植物长期协同进化过程中，形成了复杂的互作关系。当棉蚜为害寄主植物时，棉蚜唾液中的特异性激发子被寄主植物细胞表面的受体识别，从而诱导植物产生免疫反应。而棉蚜通过唾液中的特异性效应子抑制寄主植物的免疫防御反应[6]。棉蚜为刺吸式口器昆虫，在取食寄主植物韧皮部汁液的过程中，分泌凝胶唾液和水溶性唾液，其中水溶性唾液主要为唾液蛋白，具有引发和抑制寄主植物防御反应，促进棉蚜取食的作用[7]。

armet又称为中脑星形胶质细胞衍生神经营养因子（MANF），具有内质网滞留信号，在内质网胁迫中，响应非折叠蛋白反应（UPR）[8]。在蚜虫中，armet是一种钙离子结合蛋白，是蚜虫唾液腺中高表达蛋白之一[9]。armet随唾液分泌到寄主植物中，与筛管中的Ca2+结合，从而防止Ca2+与Forisome蛋白结合，致使筛管无法被Forisome蛋白阻塞，抑制寄主植物的免疫防御反应，而利于蚜虫取食[10]。

棉蚜的唾液蛋白是棉蚜与寄主植物相互作用的桥梁，在棉蚜寄主转换及适应不同寄主的过程中具有重要作用。本文分别以棉蚜的两种寄主专化型：棉花型棉蚜、黄瓜型棉蚜为研究对象，研究棉蚜唾液蛋白基因armet在棉蚜两寄主专化型中的表达谱，以及两种寄主专化型在中间寄主——西葫芦上饲养4代后，armet基因表达量的变化。以期阐明棉蚜唾液蛋白基因armet在不同寄主专化型棉蚜中的表达情况及棉蚜寄主转移中的作用，为更进一步研究armet基因在棉蚜中的具体作用指明方向，为更加有效地防治棉蚜提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试植物

试验所用棉花Gossypium hirsutum Linn.品种为‘中棉所49，由中棉所种质资源中期库提供；黄瓜Cucumis sativus Linn.品种为‘新津优一号，西葫芦Cucurbita pepo Linn.品种为‘极早优美，购于市场。将试验所用植物材料种植于人工气候室内，温度（26±1）℃，湿度70%～80%，光周期L∥D=14 h∥10 h。

1.2 供试昆虫

棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜分别采自中国农业科学院棉花研究所东场试验田的棉花和黄瓜植株上，分别由一头成蚜单独饲养，繁殖获得单克隆系。饲养条件：温度（26±1）℃，湿度70%～80%，光周期L∥D=14 h∥10 h。

将棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜的成蚜分别接到放于培养皿中的离体棉花和黄瓜叶片的背面，叶柄用浸透水的脱脂棉包裹，以保持叶片的新鲜，24 h后去除成蚜，留若蚜于皿中，继续饲养，每天观察蚜虫蜕皮情况，并适时更换叶片。分别收集棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜1、2、3、4龄若蚜和1、3、5、7日龄成蚜样品，每个时期收集约30 mg为一组，共收集3组。将棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜的成蚜分别接于离体的西葫芦叶片上，分别收集每一代棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜3龄若蚜和3日龄成蚜样品，共收集4代，每个时期的蚜虫取约30 mg为一组，收集3组。液氮速冻后保存于-70℃冰箱中备用。

1.3 棉蚜总RNA的分离及cDNA的合成

棉蚜总RNA的提取按照Trizol试剂（Ambion公司）说明书进行。运用Nanodrop 2000及琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度、纯度以及其完整性。利用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT Reagent Kit （Perfect Real Time）试剂盒，将以上不同时期棉蚜的总RNA反转录为单链的cDNA。

1.4 基因克隆

以本实验室得到的棉蚜转录组数据库为基础，并结合NCBI数据库，利用BLAST比对，获得棉蚜的armet基因序列。运用Primer Premier 5.0设计引物。armet的上游引物为5′-CGAACATTTACTGAAGAAGATTG-3′，下游引物为5′-TTATAACTCATCTTTGACGAAAG-3′。PCR反应体系为：PrimeSTAR Max DNA聚合酶（TaKaRa公司）25 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反应条件为：98℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，共35个循环。

PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收纯化，按照 pEASY-T3 Cloning Kit试剂盒（全式金公司）的说明书将其连接到T载体上，然后转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，进行测序。

1.5 序列分析

运用SignalP4.1在线软件（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽。运用ExPASy在线软件（http：∥web.expasy.org/protparam/）分析编码蛋白质的理化性质。在NCBI上，通过BLAST比对搜索同源基因，运用软件DNAMAN进行氨基酸序列比对。运用MEGA 5.05软件中的UPGMA法进行1 000次重复，构建进化树。

1.6 荧光定量PCR

根据armet基因的序列设计定量引物，选取棉蚜的ACTIN和DIMT作为内参基因。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

荧光定量PCR反应使用Promega公司的GoTaq qPCR Master Mix荧光定量试剂盒，反应体系为：上下游引物各0.85 μL，qPCR MasterMix 10 μL，cDNA模板1.0 μL，最后加ddH2O補齐至20 μL，混匀，离心放入荧光定量PCR仪中扩增。反应程序为95℃变性2 min；接着进行40个循环，循环条件为95℃，15 s；60℃，1 min。每个样品做3次技术重复。使用仪器为Eppendorf公司的Mastercycler ep realplex荧光定量PCR仪。反应结束后，根据Ct值，采用2-△△Ct法[11]进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 armet基因的克隆与序列分析

通过基因克隆的方法得到棉蚜的armet基因（GenBank登录号为KY612465）（图1）。其开放阅读框全长为522 bp，编码173个氨基酸，推测其蛋白质的分子质量为20.3 kD，等电点为6.62，具有8个保守的半胱氨酸位点，通过SignalP4.1预测其蛋白信号肽为21个氨基酸。在氨基酸序列的C-末端具有内质网滞留信号位点KDEL。

经BLAST比对后，我们选取豌豆蚜Acyrthosiphon pisum（GenBank登录号：XP_001949541.1）、麦双尾蚜Diuraphis noxia（GenBank登录号：XP_015365890.1）、中华按蚊Anopheles sinensis（GenBank登录号：KFB4-0515.1）、家蝇Musca domestica（GenBank登录号：XP_005185002.2）、家蚕Bombyx mori（GenBank登录号：XP_004921981.1）armet基因编码的氨基酸序列，与棉蚜的氨基酸序列进行同源性比对（图2），其中豌豆蚜与棉蚜armet基因编码的氨基酸序列同源性最高，为95%。可以看出该基因在昆虫的进化过程中是高度保守的。

运用MEGA5.0软件，采用UPGMA法对包括棉蚜在内的21种昆虫的armet基因编码的氨基酸序列进行系统进化树的构建。从系统进化树的分析结果可以看出，棉蚜的armet基因与蚜科昆虫的同源性较高，而与其他昆虫的同源性较低，分属不同分支（图3）。

2.2 armet基因的时间表达谱

2.2.1 黄瓜型棉蚜的armet基因的时间表达谱

运用荧光定量PCR检测armet基因在黄瓜型棉蚜不同发育时期的相对表达量，结果显示armet基因在黄瓜型棉蚜生长发育的各个时期均有表达，在若蚜的早期及中期（1～3龄）表达量相对较低，4龄表达量有所上升，但差异不显著，1日龄成蚜与4龄若蚜基因的表达量相同，1日龄成蚜基因的表达量显著降低，5日龄成蚜基因表达量再次上升（图4）。

2.2.2 棉花型棉蚜的armet基因的时间表达谱

运用荧光定量PCR检测armet基因在棉花型棉蚜不同发育时期的表达水平。在棉花型棉蚜的若虫期，armet基因的表达量呈现出升高趋势，但差异不显著。在成虫期，armet基因的表达量呈现先下降后升高的趋势。在棉花型棉蚜的整个发育时期，3日龄成蚜的表达量最低，显著低于3、4龄若蚜和7日龄成蚜（图5）。

2.3 寄主转接后基因armet表达量的变化

2.3.1 黄瓜型棉蚜转接西葫芦前后基因armet表达量的变化

将黄瓜型棉蚜转接到中间寄主西葫芦上后，各代3龄若蚜armet基因的表达量均高于转接前取食原寄主黄瓜的表达量。转接后，基因armet的表达量呈现先升高后降低的趋势，其中转接后第二代3龄若蚜表达量最高，但各代之间差异不显著（图6）。

将黄瓜型棉蚜转接到中间寄主西葫芦上后，armet基因的表达量呈现先升高后降低的趋势，其中第1、2、3代3日龄成蚜armet基因的表达量均高于转接前的，且第2代3日龄成蚜armet基因的表达量显著高于转接前（图7）。

2.3.2 棉花型棉蚜转接西葫芦前后基因armet表达量的变化

将棉花型棉蚜转接到中间寄主西葫芦上后，各代3龄若蚜armet基因的表达量均低于转接前取食原寄主棉花的表达量。转接后，基因armet的表达量呈现逐代降低趋势，各代之间基因表达量差异不显著（图8）。

转接到中间寄主西葫芦上后的棉花型棉蚜，各代3日龄成蚜armet基因的表达量均高于转接前取食原寄主棉花的表达量。转接后，基因表达量呈现逐渐降低的趋势。转接前后差异不显著（图9）。

3 讨论

armet是蚜虫唾液腺分泌蛋白，对蚜虫的取食具有积极促进作用。本研究首次克隆了棉蚜的唾液蛋白相关基因armet的cDNA序列，并对该基因编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析。分析结果表明，该基因具有armet的典型特征，具有8个保守的半胱氨酸位点。armet基因编码的氨基酸序列的N端具有一个由21个氨基酸组成的信号肽，这与唾液蛋白为外分泌蛋白的特征一致。在氨基酸序列的C端具有内质网滞留信号位点：KDEL，预测该基因参与内质网胁迫的相关反应。从系统进化树的分析结果可以看出，棉蚜的armet基因与蚜科昆虫的同源性较高，而与其他昆虫在进化树上分属不同分支，说明在功能上已与其他昆虫的armet产生了一定的分化。

昆虫的寄主专化性是指昆虫对特定寄主取食的专一性反应，即对不同种类的寄主植物和不同的取食部位的嗜食程度[12]。在昆虫与寄主植物长期协同进化的过程中，昆虫为了适应寄主植物和不断变化的自然环境，会导致同一物种不同种群间适应性的改变，因而分化出不同的寄主专化型。虽然棉蚜为多食性昆虫，但其对广泛寄主长期的适应过程中，已形成了相对严格的寄主专化型[13]。

通过荧光定量的方法对棉蚜的两个寄主专化型：棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜中的armet基因的时间表达谱进行了研究，研究发现，armet基因在棉蚜的两个寄主专化型生长发育的各个时期均有表达，且表达量都具有先升高后降低再升高的变化趋势。在若虫的晚期及成虫的初期armet基因的表达量出现一个峰值，这与赤拟谷盗中的研究结果一致[14]。说明armet基因在棉蚜的不同寄主专化型中的表达量的变化趋势是大体相同的，但具体到每个时期，又具有各自的特异性。

將棉花型棉蚜转移到中间寄主西葫芦上培养4代，转接后，armet基因在各代3龄若蚜中的表达量具有先升高后降回转接前表达量的趋势，在3日龄成蚜中也有相同的趋势。将黄瓜型棉蚜转接到西葫芦上后，armet基因无论在若蚜还是成蚜中的表达量都具有逐代降低的趋势，但各代之间armet基因的表达量变化差异不显著，与转接寄主前变化差异也不显著。说明armet基因在棉蚜的不同寄主专化型之间具有不同的变化趋势，相同寄主专化型中在成蚜和若蚜中的变化趋势相同，但armet基因在寄主转换过程中发挥的作用并不相同，这可能由于西葫芦与黄瓜的亲缘关系近于西葫芦与棉花的亲缘关系，转接后承受的植物防御压力也不同。

研究表明，蚜虫中armet基因表达蛋白为钙离子结合蛋白[9]，能够阻断响应钙离子激活筛管闭合机制中的forisome蛋白形成缔结而阻塞筛管缺口[10]，具有直接抑制植物防御反应的作用。本研究的结果表明，armet基因在各个生物型棉蚜原始寄主上整个生命活动过程中均起重要作用，在不同专化型棉蚜寄主转接试验的成、若蚜中发挥不同作用，为下一步研究armet基因在棉蚜中的具体作用和功能奠定了重要基础。

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（責任编辑：田 喆）