组织芯片结合图像分析技术研究兔死后DNA不同时间段的变化△

罗国厂 杨 坦 张春玉 吴新杰 熊 平

(南阳医学高等专科学校 南阳 473000)

很多法医实践工作中，法医工作者不仅仅要解决死者年龄、死者身份、死亡原因、死亡性质以及致死手段等问题，还有死后间隔时间(postmortem interval, PMI)的估计。死后间隔时间在刑事案件和意外死亡案件中非常重要，准确评估PMI为案件侦破提供重要线索。因此，推断PMI一直是法医学者研究的重要课题之一[1～2]。

脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)是生物体细胞中的遗传物质，每个细胞的DNA结构和含量相当稳定，一般情况下，每个细胞核的DNA含量不变。但是，机体死亡后，细胞核DNA会发生降解，且DNA降解的速度在一定时间内存在一定的规律，因此对DNA进行定量检测来推断死亡时间是一种有效的方法。组织切片经过特殊染色(Feulgen染色)后可以利用图像分析技术特异性测定DNA灰度值，用已知定量细胞(淋巴细胞)DNA含量做对照，从而得到细胞DNA含量[1]。

组织芯片也称组织微阵列(tissue microarray,TMA)技术，是在一个玻片上包含多个组织，一起切片、一起染色，具有平行、高通量等优点[3]，用组织微阵列技术对多个组织进行处理，可以获得大量的数据资料，节约了组织材料，而且实验条件一致可减小实验误差，用于推断PMI具有不可比拟的优越性。

图像分析技术(Image analysis technology ，IAT)是用已知组织含量的前提下，利用计算机技术对特殊染色的组织进行对比，实现定量分析。

IAT结合TMA研究机体死后组织细胞DNA变化，样本量大，条件一致性、可比性增强，为准确推断PMI成为可能。

1 材料与方法

1.1 材料

取雄性健康新西兰兔39只(每只重量在2.5～3.0kg)，随机分为13组，每组3只，随机在动物房散养。实验环境温度控制在20～25℃，每组3只，开始实验前首先称重，根据不同个体重量，用20%乌拉坦静脉麻醉，颈动脉放血死，在死后每隔4h解剖一组，取实验需要的组织，10%甲醛固定。

选取人体离体组织(明确离体时间)，20～25℃保存，间隔4h，在离体0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h分别取0.5×0.5cm肌肉组织，10%甲醛固定。

1.2 方法

1.2.1常规组织蜡块制作，HE染色后了解取材情况，初步了解细胞细胞核变化

选取各个不同时间段的组织，按照常规石蜡切片制作要求制作蜡块，切片、HE染色，显微镜下观察细胞核变化情况，评估蜡块质量，选取典型部位。

1.2.2两组织芯片的制作[3]及Feulgen染色

芯片各个位点排列：组织标本在组织芯片上按照时间点顺序排列，第一个设计为空白点，便于识别，从左到右按时间顺序，依次为离体0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h的组织(共3组)。

芯片制备：将熔化石蜡制作的空白蜡块,设计6×7点组织列阵、打孔，在各时间点供体蜡块上标记所需靶点，45℃烘10min，取样器钻取靶点组织，逐个取出组织芯，放入预先设计的阵列模块中，将制成组织芯片倒置，55℃，30min，轻压模块排平。

切片、Feulgen染色[1](1M HCl 、60℃下水解将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，嘌呤脱下，去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色，只有DNA才具有这种专一的反应)、脱水、透明、封固。

1.2.3图像分析、数据采集

Feulgen染色后的组织芯片的DNA显紫红色，在550nm的光波照射吸收光最强，所测积分光密度与细胞的DNA含量成正比，图像采集使用(560±10)nm的滤光片，每个芯片的观察视野设定测量范围、利用滤光片减背底、每个细胞进行分割(明确范围)、滤波、对一些聚焦不清和重叠的细胞进行删除，全部设定完毕后开始自动测量，所得数据以人淋巴细胞核作对照，计算细胞DNA含量平均值，每个芯片位点测量细胞数不少于50个[1]。

1.3 统计分析

2 结果

图1 兔肌肉组织芯片

图2 低倍镜下组织芯片的一个点(兔肾脏)10×10

图3 Feulgen染色，经过滤光处理后兔肾组织芯片视野表现10×40

2.1 兔组织细胞核DNA含量与PMI关系相关分析

时间为因变量，DNA平均含量为自变量，进行用单因素方差分析，所得相关方程式。

骨骼肌组织相关方程式为：Y=-0.0175x+6.997

肝脏组织相关方程式为：Y=-0.0208x+7.175

脾脏组织相关方程式为：Y=-0.0474x+6.641

心肌组织相关方程式为：Y=-0.0253x+7.823

肾脏组织相关方程式为：Y=-0.0415x+6.721

睾丸相关方程式为：Y=-0.0244x+8.277

肠相关方程式为：Y=-0.0506x+7.002

胃相关方程式为：Y=-0.0419x+6.242

膀胱相关方程式为：Y=-0.0279x+7.531

胆囊相关方程式为：Y=-0.0292x+6.767

气管组织相关方程式为：Y=-0.0274x+7.857

肋软骨相关方程式为：Y=-0.0174x+7.753

角膜相关方程式为：Y=-0.0214x+7.025

脑组织相关方程式为：Y=-0.0487x+6.951

2.2 兔各组织细胞核DNA降解的时序性分析

各个组织由于其所处机体位置、自身质地、酶含量等条件不同，所以出现平台期的时间不一样，其中脑组织最早、其次为肠、脾组织等。

通过比较各组织细胞核DNA降解的时序性，初步了解不同组织降解影响因素具有差异。

2.3 人体组织细胞核DNA含量与PMI相关方程式

肌肉组织细胞核DNA降解相关方程式为：Y=-0.0193x+7.896，决定系数R2=0.9005，DNA含量与PMI呈明显的负相关。

2.4 不同组织细胞核DNA含量与PMI关系的多元回归分析

肌肉细胞核DNA含量和PMI数据之间进行多元线性回归分析：

Y=484.4-45.1X1-18.2X2(Y为PMI，X1为人肌肉DNA，X2为兔DNA)，决定系数R2=0.911，P=0.000。

PMI为因变量，把兔各组织DNA含量作自变量，按a=0.1引入自变量标准，进行逐步回归分析，各因素之间有显著差异(P<0.05)。

3 讨论

自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来，Feulgen染色仍是DNA定量主要染色方法之一。Feulgen染色经典显示脱氧核糖核酸的方法具体原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，呈现出紫红色，从而显示出DNA的分布，可以鉴定DNA。

机体死亡后，溶酶体膜破裂细胞自溶，最终溶解消失[4]。在细胞自溶的过程中细胞核中的DNA在多种原因作用下逐步降解，最后完全消失。细胞DNA含量随着PMI延长而逐渐减少，平台期后与PMI呈时间依赖性关系，已经有多位法医工作者的证实[1,5～7]

本实验结果表明：组织细胞核DNA在经过一个平台期后，含量逐渐下降，随着PMI的延长而逐步下降，进一步验证了以前的论述[1,5～7]。我们利用离体的人体组织和兔组织DNA降解进行比较，证实两者具有高度相关性，证实可以利用动物组织DNA降解情况作为人体PMI研究的依据。

本次用组织芯片技术和计算机图像分析技术来研究DNA和PMI的相关性，高通量特点可以包容大量的信息，同时大量组织在同一条件下进行测量，能保证实验条件的一致性[1]。两种仪器操作较简单、方便，为将来广泛地应用提供了可能。

参 考 文 献

1 罗国厂,熊平.比较人和兔细胞DNA降解来推断人死亡时间的可行性研究.衡阳:南华大学学报,2007.

2 林旭,尹雅莎,冀强.DNA定量技术在死亡时间推断中的研究进展.法医学杂志,2011,27(1):47～51.

3 陈杰伟,刘君,张淦梅,等.高效实用的组织芯片免疫组织化学对照体系的建立.中国组织化学与细胞化学杂志,2017,26(2):170～177.

4 罗国厂,熊平.组织芯片在推断死亡时间中的应用探讨.南华大学学报(医学版),2006,34(5):631～633.

5 龙仁,黄安,王伟平,等.低温下大鼠死后骨骼肌及肝组织平均ATP含量变化与PMI关系的研究.美国中华临床医学杂志,2005,7(3):184～185.

6 舒细记,王树法,李艳,等.死后5～36h人脑细胞DNA降解含量的图像分析.第三军医大学学报,2005,8(4):796～798.

7 熊平,郭平,张静.组织细胞DNA降解与死亡时间的相关性的显微拉曼光谱分析.光谱学与光谱分析,2010,30(1):1511～1515.