OSAHS合并认知障碍患者肺泡巨噬细胞表达TREM2的研究

王耀炜 王惠芳 程旭东

西安医学院第二附属医院呼吸科（西安710038）

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstruc⁃tive sleepapnea⁃hypopnea syndrome，OSAHS）以睡眠过程中反复发生的低通气及呼吸暂停导致低氧血症、睡眠片段化为其特征。目前越来越多的证据表明OSAHS可引起患者不同程度的认知功能障碍，甚至与阿尔茨海默病（AD）的发生、发展相关［1］。髓样细胞表达的触发受体2（triggeringreceptor ex⁃pressed on myeloid cells，TREM2）是近年来发现的一个免疫球蛋白超家族受体，主要表达于巨噬细胞、中性粒细胞、小胶质细胞等［2］，最新的研究表明TREM2 mRNA在认知障碍、AD患者中高表达，可能为AD的诊断提供新的生物学方法［3］。目前对于TREM2是否在OSAHS合并认知障碍患者肺泡巨噬细胞上表达，以及其表达变化是否与认知障碍相关的研究较少。本研究通过观察TREM2 mRNA及其蛋白在OSAHS合并认知障碍患者AM上的表达规律，初步探讨其作用机制，为将来防治OSAHS患者发生认知障碍奠定基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2014年9月至2016年5月就诊于西安医学院第二附属医院呼吸内科并行多导睡眠图检测确诊为OSAHS患者79例，其中男61例，女18例，年龄42～74岁，平均（58.15±5.43）岁，均符合中华医学会呼吸病学分会睡眠呼吸疾病学组制定的睡眠呼吸暂停综合征诊断标准［4］。所有受试者均无慢性阻塞性肺疾病、肺源性心脏病、急慢性心脑血管病、严重的躯体疾病或精神类疾病、慢性酒精中毒、严重肝病、肝性脑病、低血糖反应、糖尿病酮症等与认知障碍相关的疾病。所有入选病例均由我科受培训医务人员应用MMSE量表评估，包括定向、记忆、计算、语言、视空间、运用、注意等方面，总分30分。并按照评估结果将入选病例随机分为以下4组。A组（无认知障碍组MMSE≥27）；B组（轻度认知障碍21≤MMSE＜27）；C组（中度认知障碍10≤MMSE＜20）；D组（重度认知障碍MMSE ＜9）。4组入选病例患者年龄、性别比例、受教育程度、吸烟均无统计学差异，所有入选者均知情同意，并经过我院伦理委员会通过。

1.2 AM的分离、提取、纯化分别对A～D 4组患者行支气管肺泡灌洗术，2%利多卡因经滴鼻麻醉后，使用纤支镜前端楔入患者右肺中叶支气管开口处，注入37℃、0.9%生理盐水100 mL，负压回吸收量大于总量的40%为回收成功。使用Ficoll（GE医疗生物科学中国有限公司，中国）密度梯度离心和贴壁法原代分离BALF中肺泡巨噬细胞，经过台盼蓝和吞噬试验证实活性纯度＞99%后，在37℃、5%CO2的条件下培养12 h后备用。

1.3 RT⁃PCR测定肺泡巨噬细胞TREM2 mRNA表达按Trizol试剂说明书分别提取各组AM总RNA，分别于核酸蛋白质分析仪上测定各组各自总RNA的质量和纯度。各取3 μg总RNA经M⁃MLV逆转录酶逆转录，获得cDNA后进行PCR扩增。PCR引物设计如下：TREM2上游引物：5′⁃TG⁃GTCAGAGGGCTGGACTGT⁃3′，下游引物5′⁃TCCTG⁃GCTGGACTTAAGCTGTAG⁃3′，产物大小 120 bp；β⁃actin 上游引物：5′⁃AGCGGTTCCGATGCCCT⁃3′，下游引物5′⁃AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG⁃3′，产物大小123 bp。TREM2 PCR反应条件为94℃2 min，然后94℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。β⁃actin的PCR条件为：94 ℃3 min，94℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，30个循环。RT⁃PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用Biometra全自动凝胶成像及分析系统分析，结果以光密度（OD）值表示TREM2 mRNA的相对表达量。

1.4 流式细胞仪检测肺泡巨噬细胞TREM2蛋白的表达以上分离提取的四组患者AM分别进行流式细胞仪（BD公司）检测，CellQuest软件分析。

1.5 磁共振弥散张量成像测定四组患者额叶白质FA值先行头颅MR检查，之后再行DTI。参数：MR为 27.3 ms的 TE，1 794 ms的TR，1 100 ms的TI，240 mm的FOV，0.5 mm的间距，1.0 mm的厚度等；DTI为704个采集层，16个序列方向，轴面扫描层与AC⁃PC线平行。图像采用the Functool image analysis（AW4.4 workstation工作站）处理，通过圆形感兴趣区（ROI）分析各组额叶白质FA 值［5］。

1.6 统计学方法计量资料以均数±标准差表示，资料分析采用SPSS 17.0统计软件中的单因素方差分析，各组间多重比较采用最小显著差法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组AM中TREM2 mRNA、TREM2蛋白表达TREM2 mRNA及蛋白表达量A组＜B组＜C组＜D组，各组两两比较均P＜0.05，见表1。

2.2 各组患者额叶白质FA值比较A～D组患者额叶白质FA值分别为（0.713±0.062）、（0.698±0.053）、（0.437 ± 0.051）、（0.238 ± 0.032），除 A、B组差异无统计学意义外，其余各组两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 TREM2 mRNA、TREM2蛋白表达水平与额叶白质FA值相关性分析TREM2 mRNA及蛋白表达均与额叶白质FA值呈负相关（r分别为-0.583、-0.472，均P＜0.05）。

3 讨论

OSAHS是一种常见的睡眠呼吸障碍疾病，常伴有间歇性低氧血症、夜间觉醒、白天嗜睡及认知功能障碍等症状和体征。国内外的研究均发现OSAHS可影响人心理状况改变，并可引起认知功能受损［6］。MORISSON等［7］利用脑电图监测OSAHS患者发现觉醒状态下整个皮质脑电图频率均减慢，且与夜间氧饱和度下降正相关，提示OSAHS认知功能损害具有广泛性，同时发现OSAHS患者存在不同类型、不同程度的认知障碍，这与其病情程度存在一定相关性［8］。一些研究调查了OSAHS患者与认知功能障碍的关系，提示重度患者比轻中度患者更容易出现认知功能障碍［9］。TREM2在多种髓系细胞中表达，包括单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞等中［10］。既往研究中发现，多囊性脂膜样骨发育不良并硬化性白质脑病是一种TREM2基因突变的疾病，其主要临床特点是痴呆和全身多发性骨囊肿［11］。此外，临床研究中发现，在AD患者中存在TREM2基因的突变，TREM2基因突变会使人患晚发性AD的风险高3倍，TREM2与人类认知障碍密切相关［12］。TREM2是否与OSAHS患者认知障碍的发生相关是本实验研究重点。

表1 肺泡巨噬细胞TREM2 mRNA及蛋白表达比较Tab.1 Comparison of TREM2 mRNA and protein expression in alveolar macrophages ±s

表1 肺泡巨噬细胞TREM2 mRNA及蛋白表达比较Tab.1 Comparison of TREM2 mRNA and protein expression in alveolar macrophages ±s

注：与A组比较，*P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05；与C组比较，△P＜0.05

组别A组B组C组D组例数21 23 20 15 TREM2 mRNA 5.38±0.26 7.82±0.38*9.38±0.63*＃12.57 ± 0.65*＃△TREM2蛋白50.35±3.58 68.72±5.46*80.53±7.42*＃96.48 ± 8.35*＃△

脑白质是大脑内部神经纤维聚集的地方，既往对认知功能的研究多集中于脑灰质，近年越来越多的研究认为脑白质同认知功能也存在着密切联系。弥散张量成像（DTI）技术是近年来发展成熟的一种无创、自动、高效地评估脑白质纤维完整性的方法。DTI可定量评估白质纤维束受损程度，FA值主要反映白质纤维束髓鞘完整性、致密性及平行性，FA值减低是白质纤维变性的敏感指标［13］。对不同年龄人群脑白质DTI的研究发现：随年龄增长FA值下降，提示脑白质构成变化及完整性降低，且认知功能下降［14］。本实验采用DTI技术检测OSAHS合并认知障碍患者额叶白质FA值，并分析其与TREM2 mRNA和蛋白表达的关系，初步探讨TREM2在OSAHS患者发生认知障碍过程中的作用，为将来此类疾病的防治提供依据。

巨噬细胞是天然免疫系统的重要组分，分布在人体的各个组织，在肺里称“肺泡巨噬细胞”，在神经系统称“小胶质细胞”，在骨组织称“破骨细胞”。既往关于TREM2与认知障碍的研究多集中于破骨细胞与小胶质细胞。PALONEVA等［15］的研究结果表明，TREM2具有抑制小胶质细胞和破骨细胞内细胞因子表达的作用，从而使中枢神经系统内和骨骼组织中的炎症反应受到抑制。SHARMA等［16］研究发现在OSAHS患者中AM的功能障碍变得更加严重，可能增加对疾病的易感性，所以本研究选择提取、纯化各组患者AM并检测其TREM2的表达水平。

本研究结果显示OSAHS合并认知障碍各组患者随着认知障碍的加重，TREM2 mRNA及蛋白的表达量明显增加，重度认知障碍组的表达量达到最高，各组组间比较均具有统计学意义（P＜0.05）。与之相反，各组患者额叶白质FA值随着认知障碍加重明显减小，相关分析显示TREM2 mRNA及蛋白表达与额叶白质FA值均呈负相关（r分别为⁃0.583、⁃0.472，P＜ 0.05）。从而初步推断TREM2的表达在OSAHS合并认知障碍患者疾病发生、发展的过程中可能起重要作用，具体TREM2如何参与认知障碍过程中的调节机制目前尚不清楚。近期在有关TREM2与AD的研究中发现，AD患者外周血和AD模型动物脑内TREM2水平显著升高［17］，TREM2在脑中具有抗炎作用，其是通过调节小胶质细胞炎症反应在AD发病过程中起重要作用。当机体受到内外因素损害时，炎症因子会激活小胶质细胞膜上受体TREM2，其通过TREM2/DAP12信号通路，上调IL⁃10、IL⁃4等抑炎因子的表达，从而减少炎症反应［18］，减轻对神经细胞的损伤，从而减轻AD疾病的进展。当炎症刺激因子表达过度时TREM2调节能力下降，促炎因子增多，增加对大脑的损害，TREM2可能是AD患者认知障碍发展过程中的保护性受体。从而我们初步推测OSAHS患者由于长期存在低氧血症、高碳酸血症等刺激因素可能导致慢性炎症反应，炎症因子激活AM表达TREM2，TREM2起初通过表达增加来抑制炎症反应，抑制炎症因子对神经细胞的损害，减缓认知障碍发生速度，当OSAHS患者病情逐渐加重得不到及时治疗时炎症因子刺激作用增加，TREM2调节作用下降，炎症因子对神经细胞的损害持续加重最终导致认知障碍逐渐加重。至于TREM2调节OSAHS患者发生认知障碍过程中的具体分子生物学机制仍需进一步研究。

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