血红蛋白Bart′s水肿胎儿综合征诱导多能干细胞系的建立

冼业星 严金梅 陈玉嫦 李东至 孙筱放

1广州医科大学附属第三医院，广东省普通高校生殖与遗传重点实验室，广东省产科重大疾病重点实验室（广州510150）；2广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心，产前诊断中心（广州 510623）

地中海贫血（thalassemia，简称地贫）又称海洋性贫血，是临床常见的一组珠蛋白生成障碍性常染色体隐性遗传性疾病。因其最早在意大利、希腊、马耳他等地中海沿岸国家发现而得名，该种疾病在东南亚、地中海等地区较为常见。根据珠蛋白基因缺陷的不同分类，而以α地中海贫血和β地中海贫血两种分型最为常见。其中α-地中海贫血是一组以珠蛋白合成减少，α-链/非α-链比例失衡为特征的遗传性溶血性血红蛋白病。在我国南方α-地中海贫血的高发区中，广西、广东、江西、四川和浙江各省的发病率分别为14.95%、4.11%、2.6%、1.92%和1.20%［1］。虽然产前诊断技术飞速发展，但是我国每年仍有不少的α-地贫患儿出生。血红蛋白 Bart′s（Hb Bart′s）水肿胎儿综合征是a-地中海贫血纯合子型，是罕见的新生儿或胎儿严重溶血的致死型，自1960年起国内外就开始有陆续报道［2］。正常人有4个α基因，即αα/αα，当 4 个α基因缺失时⁃⁃/⁃⁃即为Hb Bart′s胎儿水肿综合征。最常见的缺失型如东南亚缺失型（⁃⁃SEA）全部缺失了两个α基因，即当一对夫妇均为此型时，则胎儿有1/4机会遗传有Bart氏综合征风险。患者在胎儿时期就出现了大量γ链合成γ4，因其对氧的亲合力极高，导致组织缺氧而造成胎儿水肿综合征，孕妇常在妊娠30～40周时便出现流产、死胎或者胎儿在娩出后30 min内死亡。东南亚缺失等位基因在华南地区人群中达4%～8%，而在泰国北部甚至高达14%［3-4］。

诱导多能干细胞（iPS）技术在2006年［5］出现，并在近几年发展迅速，为再生医学研究提供了一个理想的研究及治疗模型。近年来，科学家们利用诱导多能干细胞分化的特性来进行向各种体细胞的分化以探讨疾病发病机制和治疗，如神经细胞和造血细胞等［6-7］。而目前通过使用Hb Bart′s胎儿水肿综合征疾病来源的诱导多能干细胞作为材料进行该病相关机制及治疗研究尚未报道，因此本研究通过收集Hb Bart′s胎儿水肿综合征孕妇羊水细胞，利用仙台病毒来诱导建立诱导多能干细胞系，评估相关干细胞多能性，为下一步治疗研究提供理想的细胞模型。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂细胞培养皿、15/50 mL离心管和冻存管（Corning），羊水培养基（AmnioMAX⁃TM⁃Ⅱ），PCR扩增试剂盒（北京天根），Knockout DMEM培养液、Knockout血清替代培养物、NEAA、GlutamaxTM 和 P/S（GIBCO），bFGF（Peprotech），Cy⁃toTune®⁃iPS 2.0 Sendai重编程试剂盒（Life）、Trizol试剂（Invitrogen），PBS，mTeSR1（Stem cell），EDTA，胰酶，TritonX⁃100，DAPI染液（ROCHE），AP 染色试剂盒（上海斯丹赛），实验用引物（上海捷瑞），抗体OCT4、SSEA4、TRA⁃1⁃81、SMA和AFP（Abcam），抗体SOX2、Nestin（ABGENT）。

1.2 仪器与设备激光共聚焦显微镜、倒置显微镜和体视显微镜（Nikon），台式离心机（Eppendorf），恒温水浴箱（Memmert），生物安全柜、移液枪、培养箱和-80℃冰箱（Thermo），PCR仪（ABI），电泳仪和凝胶成像分析仪（Bio⁃Rad），液氮罐（MVE），4/-20℃冰箱（Haier）。

1.3 羊水细胞的采集和培养胎儿诊断为纯合性α-地中海贫血（⁃⁃SEA/⁃⁃SEA）的孕妇获得知情同意之后，在妊娠16周时在超声引导下进行羊膜穿刺术，抽取10 mL羊水，通过1 000 r/min离心5 min收集羊水细胞。弃上清，将细胞悬浮于4 mL羊水培养基中，将其转移至6 cm培养皿中放置于含有5%CO2的37℃潮湿的培养箱中培养。7～8 d后更换4 mL新鲜的培养基。在细胞达到80%～90%融合时进行细胞传代培养，使用适量0.05%胰蛋白酶进行消化，并以1∶4的比例传代到相对应的培养皿中进行扩增培养。

1.4 诱导多能干细胞建系笔者使用CytoTune®⁃iPS 2.0仙台重编程试剂盒通过仙台病毒转染系统将四种转录因子 OCT4，SOX2，KLF4 和 c⁃Myc（OSKM）转入血红蛋白Bart′s患者羊水细胞中。如图1所示，转导24 h后更换新鲜羊水培养基，后每隔一天更换新鲜培养基。转导后第7天时将其消化接种到提前准备灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层上。第8天后开始换液更换为新鲜的iPS培养基，以后每天更换新鲜的iPS培养基培养，并观察克隆形成。待克隆长大后以机械切割的方式将其传代扩增，将得到的克隆吸到用matrigel覆盖的无菌培养皿中用mTeSRTM1继续培养，前1～3代时待克隆长大后以机械切割的方法传代扩增以去除分化的细胞，得到纯化的iPSc后可使用EDTA进行消化传代扩增及冻存。

1.5 iPSC多能性检测

1.5.1 碱性磷酸酶检测将细胞按1∶6～7比例传代以稀释细胞密度，4～6 d后使克隆长大后克隆之间有足够间距以便于染色观察。细胞足够大后用PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定10 min。再用PBS洗涤3次，加入碱性磷酸酶染色液在室温下避光孵育30 min。最后用PBS洗涤显微镜下观察结果。

1.5.2 免疫细胞化学染色细胞系使用4孔板上培养3～4 d后用4%多聚甲醛固定20 min，然后用PBS洗涤2次，使用透膜液0.1%的TritonX⁃100透膜20 min，加2%FBS⁃PBS室温封闭1 h。用PBS洗涤细胞，细胞与混有OCT4（1∶200）、SSEA4（1∶100）、SOX2（1/100）和TRA⁃1⁃81（1∶200）的一抗在4 ℃下孵育过夜后，用PBS清洗3遍，再与相应二抗在37℃下避光孵育2 h，用PBS清洗3遍后用DAPI染细胞核，共聚焦显微镜进行荧光拍照。

1.5.2 RT⁃PCR检测多能性基因表达使用Trizol提取已建成的诱导多能干细胞总RNA，逆转录成cDNA，RT⁃PCR检测诱导性多能干细胞中胚胎干细胞标志性基因SOX2、NANOG、LIN28和OCT4的表达情况，用胚胎干细胞H1细胞系作为阳性对照，羊水细胞作为阴性对照。PCR反应程序设置：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环扩增36次，最后72℃延伸7 min，得到的PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.5.3 诱导性多能干细胞拟胚体形成实验诱导性多能干细胞经1 g/L的Dispase消化成细胞团块后，用拟胚体分化液重悬，铺在低吸附的培养皿中，放置在37℃继续悬浮培养，隔天换液，观察拟胚体形成情况。1周后将拟胚体转移到0.1%明胶包被的细四孔板胞培养皿中继续培养。1周后，进行免疫荧光化学染色，其中外胚层的标记物为Nestin，中胚层的标记物为SMA，内胚层的标记物为AFP，在共聚焦显微镜进行荧光拍照。

1.5.4 免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成试验检测iPSCs的体内分化潜能当在matrigel包被的无菌培养皿上培养的iPSCs生长至70%的密度时，用dispase消化酶消化7 min，用1 mL枪头将细胞团吹脱，用约100 μL的DMEM/F12和Matrigel混合液（1∶1）重悬细胞，在每只免疫缺陷性（SCID）小鼠的后大腿内侧下注射收集的细胞106个细胞，大约8～10周后，当小鼠腿部的肿块直径超过2 cm时处死小鼠分离肿块。肿块在福尔马林中固定过夜，石蜡包埋并进行切片，使用苏木精伊红（HE）染色，最后显微镜下观察3个胚层的形成情况并拍照记录。

1.6 核型分析取传代后3～4 d的iPSCs，加入0.25 mg/L秋水仙素，37℃孵育3 h。用0.05%胰酶把iPSCs消化成单细胞，1000 r/min离心5 min收集细胞，0.4%枸橼酸钠：0.4%KCl=1∶1的低渗液37℃下处理5 min；加入7滴新鲜配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3∶1）进行预固定，1 000 r/min离心5 min，弃上清，再加固定液，室温继续固定40 min；离心弃上清，加入200 μL的固定液后重悬细胞，进行滴片，使用吉姆萨染色10 min，用水轻轻冲洗，在室温下风干，在显微镜下观察结果。

2 结果

2.1 转录病毒诱导SCA3皮肤成纤维细胞产生诱导多能干细胞在转导后11～14 d出现胚胎干细胞样克隆（图2B）。转导后第21～22天（图2C），克隆足够大时，在显微镜下用机械法将独立克隆切开，选择典型的克隆挑取至铺有matrigel的4孔板中，每个克隆接种到1个孔内并用mTeSRTM1培养基培养，并记作P1代。适量扩增及冻存各个代次细胞。Hb Bart′s水肿胎诱导多能干细胞形态特征（图2D）与人胚胎干细胞相似，细胞克隆呈扁平、致密，边界明显，核质比例较大。

图1 羊水细胞重编程示意图Fig.1 Flow chart of amniotic fluid cell reprogramming

图2 重编程前后细胞形态Fig.2 Cell morphology before and after reprogramming

2.2 Hb Bart′s水肿胎诱导多能干细胞iPSCs保留多能性及体外分化潜能本研究建立诱导的多能干细胞碱性磷酸酶染色呈阳性（图3），表明诱导后细胞表达高水平的碱性磷酸酶。

诱导多能干细胞进行多能干细胞的标志物SSEA4，TRA⁃1⁃81，SOX2和OCT4均阳性，DAPI为核染显示蓝色荧光（图4）。

图3 碱性磷酸酶染色（Bar=100 μm）Fig.3 Alkaline phosphatase staining（Bar=100 μm）

图4 诱导多能干细胞多能性表面特异性标志物Fig.4 Pluripotent surface⁃specific markers of iPS

RT⁃PCR结果显示诱导多能干细胞表达人胚胎干细胞多能性标志基因SOX2、NANOG、LIN28和OCT4（图5）

诱导多能干细胞通过自发分化形成拟胚体（图），并可形成表达Nestin（外胚层，图6A）、SMA（中胚层，图6B）和AFP（内胚层，图6C）3个胚层。

图5 RT⁃PCR 检测细胞系中 SOX2、NANOG、LIN28和OCT4基因表达Fig.5 Detection of the gene expression of SOX2，NANOG，LIN28 and OCT4 in cell lines by RT⁃PCR

图6 三胚层分化Fig.6 Differentiation of three germ layer

诱导多能干细胞注射到免疫缺陷小鼠8～10周后发现腹股沟处出现肿瘤。对畸胎瘤组织进行切片并HE染色表明，所形成的肿瘤存在包括有外胚层、中胚层和内胚层三个胚层分化的组织（图7）。

此外，笔者还对诱导多能干细胞进行核型分析（图8），其在体外长期培养后仍能维持正常的二倍体核型。

3 讨论

近几年诱导多能干细胞（iPS）技术的迅速发展，为再生医学研究提供了获得病人自身体细胞来源的多能性干细胞的体外培养途径，不但避免了外源细胞引起自身免疫排斥问题，而且规避了临床上的伦理问题。经过科学家们这几年的研究，已经成功建立起多种疾病病人特异性的iPS细胞系［8］。正是iPSc技术的发展，科学家们逐渐将其应用到疾病治疗方向上，如应用这种技术来治疗β地中海贫血取得重大进展，通过对自身iP⁃Sc进行修复，并最终使细胞能够表达相应的HBB蛋白［9-13］。但笔者同时也要看到iPS疾病模型的不足，如建成细胞所需要的时间成本及所用的转导方式介质对其后续的治疗影响均需要考虑。

图8 诱导多能干细胞核型Fig.8 Karyotypes of iPS

仙台病毒为非整合方法，对于基因组来说是一种产生iPSC的安全方法，且相对其他诱导方法更为高效［14-15］。笔者通过使用仙台病毒从Hb Bart′s的胎儿的人羊水细胞中建成了诱导多能干细胞，并对建立的干细胞进行了相关多能性检测。碱性磷酸酶（AP）活性通常在胚胎干细胞等全能或多能干细胞表现较高，当胚胎细胞发生分化后，AP活性随之降低，而笔者的细胞碱性磷酸酶染色结果呈阳性。另外，免疫荧光检测也是干细胞多能性常用的典型检测方法，如干细胞表面特异性标志物如SSEA4，TRA⁃1⁃81，SOX2和OCT4等，所建立的iPS均为阳性。同时对诱导多能干细胞的多能性标志基因SOX2、NANOG、LIN28和OCT4表达进行RT⁃PCR检测亦提示为阳性。笔者还对细胞进行体外和体内分化能力进行了评估，通过自发分化EB和畸胎瘤形成实验，均形成外胚层、中胚层和内胚层3个胚层，提示其分化的全能性。为了验证所产生的细胞是否有变异，本研究对细胞进行了核型分析，结果显示仍维持正常的二倍体核型。从笔者的实验结果可以看到，均提示笔者成功建立了Bart′s水肿胎儿综合征诱导多能干细胞。

α-地贫在我国南方地区为最常见的遗代传病之一，特别是Hb Bart′s为致死性疾病，目前尚无根治方法，而只有通过产前诊断来进行预防性干预，一旦发现即选择终止妊娠处理，若要治疗这种疾病可能需要进行宫内治疗。随着基因治疗方法策略的发展［10，16-17］，结合诱导多能干细胞技术，可以用其来研究对应疾病的病理机制，同时可为个体化治疗方案提供基础，利用修复遗传病突变基因，获得胎儿正常的iPS细胞，有望利用iPS技术对胎儿进行宫内治疗以减少出生缺陷所带来的巨大经济和精神负担。有了Hb Bart′s水肿胎儿综合征细胞模型，将为笔者下一步探讨该疾病研究及治疗工作提供重要工具，可以先在细胞层面上进行探究以减少直接对病人试验所带来的伤害。

［1］ZENG Y T，HUANG S Z.Disorders of haemoglobin in China［J］.J Med Genet，1987，24（10）：578⁃583.

［2］LUAN E L，HIE J B.Hydrops foetalis with a fast⁃moving hae⁃moglobin［J］.Br Med J，1960，2（5213）：1649⁃1650.

［3］XU X M，ZHOU Y Q，LUO G X，et al.The prevalence and spectrum of alpha and beta thalassaemia in Guangdong Prov⁃ince：implications for the future health burden and population screening［J］.J Clin Pathol，2004，57（5）：517⁃522.

［4］XIONG F，SUN M，ZHANG X，et al.Molecular epidemiologi⁃cal survey of haemoglobinopathies in the Guangxi Zhuang Au⁃tonomous Region of southern China［J］.Clin Genet，2010，78（2）：139⁃148.

［5］TAKAHASHI K，YAMANAKA S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.Cell，2006，126（4）：663⁃676.

［6］AMOROSO M W，CROFT G F，WILLIAMS D J，et al.Accel⁃erated high⁃yield generation of limb⁃innervating motor neurons from human stem cells［J］.J Neurosci，2013，33（2）：574⁃586.

［7］MORISHIMA T，WATANABE K，NIWA A，et al.Genetic cor⁃rection of HAX1 in induced pluripotent stem cells from a pa⁃tient with severe congenital neutropenia improves defective granulopoiesis［J］.Haematologica，2014，99（1）：19⁃27.

［8］PARK I H，ARORA N，HUO H，et al.Disease⁃specific in⁃duced pluripotent stem cells［J］.Cell，2008，134（5）：877⁃886.

［9］OU Z，NIU X，HE W，et al.The combination of CRISPR/Cas9 and iPSC technologies in the gene therapy of human beta⁃thal⁃assemia in mice［J］.Sci Rep，2016，6：32463.

［10］NIU X，HE W，SONG B，et al.Combining single strand oligo⁃deoxynucleotides and CRISPR/Cas9 to correct gene mutations in beta⁃Thalassemia⁃induced pluripotent stem cells［J］.J Biol Chem，2016，291（32）：16576⁃16585.

［11］YANG Y，ZHANG X，YI L，et al.Naive induced pluripotent stem cells generated from beta⁃Thalassemia fibroblasts allow efficient gene correction with CRISPR/Cas9［J］.Stem Cells Transl Med，2016，5（1）：8⁃19.

［12］XU P，TONG Y，LIU X Z，et al.Both TALENs and CRISPR/Cas9 directly target the HBB IVS2⁃654（C>；T）mutation in beta⁃thalassemia⁃derived iPSCs［J］.Sci Rep，2015，5：12065.

［13］MA N，SHAN Y，LIAO B，et al.Factor⁃induced reprogram⁃ming and zinc finger nuclease⁃aided gene targeting cause differ⁃ent genome instability in beta⁃Thalassemia induced pluripotent stem cells（iPSCs）［J］.J Biol Chem，2015，290（19）：12079⁃12089.

［14］FUSAKI N，BAN H，NISHIYAMA A，et al.Efficient induc⁃tion of transgene⁃free human pluripotent stem cells using a vec⁃tor based on Sendai virus，an RNA virus that does not integrate into the host genome［J］.Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci，2009，85（8）：348⁃362.

［15］SCHLAEGER T M，DAHERON L，BRICKLER T R，et al.A comparison of non⁃integrating reprogramming methods［J］.Nat Biotechnol，2015，33（1）：58⁃63.

［16］BAHAL R，ALI M N，QUIJANO E，et al.In vivo correction of anaemia in beta⁃thalassemic mice by gammaPNA⁃mediated gene editing with nanoparticle delivery［J］.Nat Commun，2016，7：13304.

［17］BAK R O，DEVER D P，PORTEUS M H.CRISPR/Cas9 ge⁃nome editing in human hematopoietic stem cells［J］.Nat Pro⁃toc，2018，13（2）：358⁃376.