PTEN基因在子宫内膜癌细胞上皮间质转化中的作用

李品莹 李小毛

中山大学附属第三医院（广州510630）

子宫内膜癌（endometrial cancer）为女性常见的生殖道恶性肿瘤之一，其病因学的分子机制尚未清楚。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）是至今发现第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因［1］，目前国内外已有实验证实该基因的突变或缺失及蛋白异常表达与子宫内膜癌、乳腺癌、胶质细胞瘤、前列腺癌、结直肠癌、胃癌等恶性肿瘤的发生息息相关［2-5］，但在PTEN基因成功转染的子宫内膜癌细胞上是否能抑制其生长，并对子宫内膜癌细胞的上皮间质转化（epithelial⁃mesenchymal transition，EMT）起作用？其关联性仍待进一步研究。故本研究拟通过转染抑癌基因PTEN至子宫内膜癌ishikawa细胞系，并检测CDH1及CDH2蛋白的表达水平，及转染后的ishikawa⁃PTEN细胞表面标志物CD133的阳性表达结果，旨在探讨PTEN基因在子宫内膜癌细胞EMT中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料子宫内膜癌细胞系ishikawa细胞购于凯基生物公司（Cat No.KG314）。细胞在含灭活的胎牛血清（FBS）、青链霉素混和液（8 000 U/mL青霉素、8 mg/mL链霉素）的RPMI1640培养基中培养。FItran慢病毒包装专用转染试剂、PEG8000慢病毒浓缩液购于辉骏生物公司，微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒I型购于中美泰和公司。UltraSYBR Mixture（High ROX）购于康为世纪（CW2602M）。HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit购于康为世纪（CW2582M）。引物由艾基生物公司合成。Anti⁃Human CD133 PE购于杰特伟生物科技公司（8512133841）。所有试剂均于使用当天配制。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞系和细胞培养子宫内膜癌细胞系ishikawa细胞，PLVX⁃PURO慢病毒载体转染后的ishikawa⁃puro细胞，PLVX⁃PURO⁃PTEN慢病毒载体转染后获得的ishikawa⁃PTEN细胞。所选用的培养基为RPMI1640完全培养基（RPMI1640＋10%小牛血清），置于5%CO2、37℃、95%相对湿度的培养箱内培养。

1.2.2 293T细胞准备取出冻存于液氮中的293T细胞，37℃水浴融化后将293T细胞接种于25 cm2的培养瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培养基，置于5%CO2、37℃、95%相对湿度的培养箱内培养。待细胞长成均匀的单层细胞且达到90%以上的聚集度时传代，先将培养基吸出再加入500 μL 0.25%胰蛋白酶，在室温下消化，并于显微镜下观察，当细胞呈现皱缩且变圆时立即加入DMEM培养基，并反复的吹打培养基使其成细胞悬液，于血球计数板计数，以含10%小牛血清的DMEM培养基调整细胞密度后，再接种于10 cm细胞培养皿，约5×106cell/皿（共10 mL完全培养基），置于5%CO2、37℃、95%相对湿度的培养箱内培养。24 h后，待细胞密度达到80%时可用于分盘至150 mm的细胞培养盘。

1.2.3 慢病毒包装（1）包装当天（分皿24 h后），将293T细胞换成20 mL的无抗DMEM培养基+10%FBS+4 mmol/L Gln，置于5%CO2、37 ℃、95%相对湿度的培养箱中培养2 h。27 μg的GSTM5慢病毒质粒及2个辅助质粒，加入1 mL的生理盐水中轻轻混合，静置5 min后加入3倍质粒量的转染试剂Polyethylenimine，静置于室温下孵化20 min后，慢慢滴入150 mm培养皿中，轻柔摇匀，此时间点标记为转染开始。经过6 h的转染后换液，吸取适量的PBS轻柔漂洗细胞2次，换上DMEM培养基 +10%FBS+4 mmol/L Gln，1%P/S培养基。

1.2.4 病毒收集于转染后的第48小时及第72小时分别收集上清液，以1 000 r/min离心5 min，用0.45 μm微孔滤器过滤上清液。以4℃，50 000g超高速冷冻离心机高速离心2 h，弃上清液，用1 mL PBS充分溶解病毒沉淀，最后以0.22 μm微孔滤器过滤，分装为100 μL/管，浓缩液保存于-80℃冰箱。

1.2.5 ishikawa细胞传代铺板将RPMI1640完全培养基、Trypsin⁃EDTA和PBS预先回温置室温。倒去培养皿中的培养液，PBS洗涤细胞2次，将残余的血清去除。倒去PBS后加入适量的Trypsin⁃EDTA，轻柔震荡，使Trypsin⁃EDTA均匀覆盖至培养器皿表面，消化约1 min后放至显微镜下见细胞变圆且间隙增大后，加入2 mL的RPMI1640完全培养基终止消化。吸取培养器皿内的液体，轻柔反覆吹打器皿表面，使细胞完全脱离器皿壁后，将细胞移入离心管中，以1 000 r/min离心5 min后，除去上清液，再加入5 mL DMEM完全培养基，反复吹打培养基使其成细胞悬液，取少量样本计数。按照计数的结果，以0.5×106cells/孔的密度接种到6孔板，总共接种3个孔。

1.2.6 ishikawa细胞感染待ishikawa细胞完全贴壁密度达50%后进行感染。于感染前，在每孔细胞更换为1 000 μL新鲜的无双抗DMEM完全培养基10 μg/mL polybrene，放置于培养箱孵育1 h。于其中一孔加入100 μL的PTEN病毒，标记为ishikawa⁃PTEN；另一孔加入100 μL的对照慢病毒，标记为ishikawa⁃puro；还有一孔细胞做为空白对照组，摇匀后置于5%CO2、37℃、95%相对湿度的培养箱中培养。侵染6 h后，将孔内的培养基吸走，换为RPMI1640完全培养基，置于35%CO2、37℃、95%相对湿度的培养箱中培养。48 h后，传代细胞，收样做Q⁃PCR。

1.2.7 QPCR检测CDH1、CDH2的mRNA表达水平用Trizol试剂提取ishikawa细胞的总RNA。取10 μL RNA用HiFiScript试剂盒合成第一条cDNA链。PCR引物由Primer premier 5.0软件设计（表1），以GADPH条带为内参照。PCR反应条件为：42℃孵育15 min，85℃孵育5 min，再进行40个以下循环98℃ 10 min，98℃ 15 s，60℃ 34 s（采集荧光信号）。循环结束后由60℃升高至98℃获取熔解曲线。

表1 PCR引物Tab.1 Degenerate primer of GADPH、CDH1 and CDH2

1.2.8 CD133表面标志物检测由ishikawa⁃puro组中取一小部分细胞到另一EP管，不加CD133抗体，作为空白对照组（Control），于ishikawa⁃PTEN组和 ishikawa⁃puro组内各加入 5 μL CD133 抗体，避光孵育30 min，1 000 rpm/min离心5 min，PBS洗涤2遍。加入500 μL PBS重悬，流式细胞仪检测CD133表面标志物阳性率。

1.3 统计学方法以SPSS 13.0软件进行数据分析，数据资料以均数±标准差表示，采用方差分析进行相关性分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CDH1、CDH2的mRNA在ishikawa细胞中的表达水平于不同的样本中，为了在待测基因中体现出差异表达，需将实验误差及样本量等因素均一化，故藉由内参基因的Ct值来平衡实验差，再以△△Ct值计算基因表达倍数参的差别，计算见表2、3。结果显示，ishikawa⁃PTEN细胞的CDH1 mRNA表达量为ishikawa⁃puro细胞的0.62倍（图1）；ishikawa⁃PTEN细胞的CDH2 mRNA表达量为ishi⁃kawa⁃puro细胞的2.07倍（图2），两组数据相比差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表2 CDH1的mRNA在ishikawa细胞的表达水平数据分析Tab.2 Data Analysis：The mRNA of ishikawa⁃puro and ishikawa⁃PTEN CDH1

图1 CDH1 mRNA表达量比较图Fig.1 The comparison of CDH1 mRNA

图2 CDH2 mRNA表达量比较图Fig.2 The comparison of CDH2 mRNA

2.2 CD133 表面标志物在 ishikawa⁃puro 与 ishi⁃kawa⁃PTEN中的阳性表达情况ishikawa⁃puro组与ishikawa⁃PTEN组比较CD133抗体阳性表达率，ishikawa⁃PTEN 组较 ishikawa⁃puro组有减少的趋势（表5），流式分析结果如下：空白对照组见图3、ishikawa⁃puro组见图4、ishikawa⁃PTEN组见图5。

3 讨论

恶性肿瘤的主要特点为局部浸润与远处转移，这也是恶性肿瘤预后不良的主要原因，研究恶性肿瘤的局部浸润及转移机制对于治疗肿瘤具有重要意义。研究指出EMT在恶性肿瘤的局部浸润与远处转移均有着重要联系［6］。

EMT最开始是在哺乳动物胚胎的发育过程被发现，原始中胚层的形成、神经脊发育成体节和肌肉等组织均涉及到EMT的过程。EMT为上皮细胞在一定条件下向间质细胞转化的过程，在增加肿瘤细胞侵扰转移机会的同时，也使得肿瘤细胞具有自我更新能力等肿瘤干细胞的特性［7］。首先细胞表面上皮标志物表达下调及间质标志物表达上调，使得上皮细胞失去细胞极性，细胞间的连接断裂，肌动蛋白骨架开始重组，之后便伴随着细胞黏附能力的下降，胞外基质金属蛋白酶（MMPs）表达增加，使细胞更容易离开所在部位［8］。EMT过

程中参与的标志物有许多，包括上皮标志物：CDH1（E⁃钙黏蛋白）、细胞角蛋白等；间质标志物：CDH2（N⁃钙黏蛋白）、波形蛋白（Vimentin）、α平滑肌肌动蛋白（α⁃SMA）等［9-10］。

表3 CDH2的mRNA在ishikawa细胞的表达水平数据分析Tab.3 Data Analysis：The mRNA of ishikawa⁃puro and ishikawa⁃PTEN CDH2

表4 CDH1、CDH2 mRNA表达水平数据统计学分析Tab.4 Statistical Analysis：The mRNA of ishikawa⁃puro and ishikawa⁃PTEN CDH1,CDH2

表5 CD133表面标志物阳性表达情况Tab.5 The expression rate of CD133

图3 空白对照组CD133表面标志物阳性表达情况Fig.3 The expression rate of CD133 in Control

图4 ishikawa⁃puro细胞组CD133表面标志物阳性表达情况Fig.4 The expression rate of CD133 in ishikawa⁃puro

图5 ishikawa⁃PTEN细胞组CD133表面标志物阳性表达情况Fig.5 The expression rate of CD133 in ishikawa⁃PTEN

钙黏蛋白是钙依赖性跨膜糖糖蛋白，介导上皮组织中的细胞连接，借以维持组织极性及完整性。钙黏蛋白按分布及结构主要可分为：E⁃钙黏蛋白，P⁃钙黏蛋白，N⁃钙黏蛋白，而E⁃钙黏蛋白转化为N⁃钙黏蛋白的过程被认为是肿瘤EMT机制的关键步骤［11-12］，研究显示，EMT的过程中均持续存在着E⁃钙黏蛋白的低表达或缺失［13-14］。

CD133为Prominin家族成员，是分子量为120 kD的细胞表面跨膜糖蛋白，由865个氨基酸组成，在间质干细胞，内皮祖细胞等细胞中均发现有特异表达［15］。CD133表达阳性细胞与多种肿瘤干细胞有相关性，其具有肿瘤恶性表型及浸润能力等肿瘤干细胞的生物学特性［16-17］，为目前公认的肿瘤干细胞表面标志物。NAKAMURA等［18］分离ishikawa细胞中CD133阳性的细胞并对其进行检测，发现CD133阳性的细胞具有更强的克隆能力、化疗耐受力及体外致瘤性。

本实验采用QPCR及流式细胞术对ishikawa⁃PTEN细胞中的CDH1、CDH2、CD133进行研究，结果显示，ishikawa⁃PTEN细胞的CDH1 mRNA表达量低于 ishikawa⁃puro细胞的表达量，ishikawa⁃PTEN细胞的CDH2 mRNA表达量则高于ishikawa⁃puro细胞的表达量，又CDH1向CDH2转化的过程被认为是EMT的关键步骤，且CDH1的低表达或缺失持续存在于EMT过程中，此结果提示了PTEN基因在抑制子宫内膜癌细胞向肿瘤干细胞转化的EMT中具有重要的作用。在CD133阳性表达率检测方面，ishikawa⁃PTEN细胞的阳性表达率比ishikawa⁃puro细胞低，鉴于CDl33表达阳性细胞具有肿瘤干细胞的生物学特性，此结果说明了PTEN基因对降低子宫内膜癌细胞的恶性表型及浸润能力起一定作用。

综上所述，PTEN基因与CDH1、CDH2、CD133均具有相关性，PTEN基因的缺失，可导致子宫内膜癌细胞EMT的发生，促进子宫内膜癌的侵扰转移，从而使子宫内膜癌患者的生存受到影响。检测PTEN基因可用于预测子宫内膜癌患者的肿瘤转移及术后复发风险，亦可为判断子宫内膜癌的恶性程度及预后提供重要的依据。进一步探讨子宫内膜癌细胞与PTEN的相互作用及其机制，将为进一步了解子宫内膜癌干细胞的生物学特性及子宫内膜癌的靶向治疗打开新的局面。

［1］LI J，YEN C，LIAW D，et al.PTEN，a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain，breast，and prostate cancer［J］.Science，1997，275（5308）：1943⁃1947.

［2］廖山婴，朱小波，王蓓蓓，等.PPARγ、PTEN、Akt在胃癌中的表达及其与胃癌生物学行为的关系［J］.新医学，2014，45（6）：394⁃398.

［3］KAFSHDOOZ L，KAFSHDOOZ T ，TABRIZI A D，et al.Role of exon 7 PTEN Gene in Endometrial Carcinoma［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（11）：4521⁃4524.

［4］CHOWDHURY S，ONGCHIN M，WAN G，et al.Restoration of PTEN activity decreases metastases in an orthotopic model of colon cancer［J］.J Surg Res，2013，184（2）：755⁃760.

［5］孟丽荣，李田，李小毛.PTEN和EGFR与子宫内膜癌发生和发展研究的最新进展［J］.肿瘤，2010，30（5）：3447⁃3449.

［6］CHA Y H，YOOK J I，KIM H S，et al.Catabolic metabolism during cancer EMT［J］.Arch Pharm Res，2015，38（3）：313⁃320.

［7］LI Y，WANG W，WANG W，et al.Correlation of TWIST2 up⁃regulation and epithelial⁃mesenchymal transition during tumori⁃genesis and progression of cervical carcinoma［J］.Gynecol On⁃col，2012，124（1）：112⁃118.

［8］RHIM A D，MIREK E T，AIELLO N M，et al.EMT and Dissem⁃ination Precede Pancreatic Tumor Formation［J］.Cell，2012，148（1/2）：349⁃361.

［9］QIAN C N，MEI Y，ZHANG J.Cancer metastasis：issues and challenges［J］.Cancer，2017，36（3）：108⁃111.

［10］TAKAHASHI E，INOUE T，FUJIMOTO T，et al.Epithelial mes⁃enchymal transition⁃like phenomenon in trabecular meshwork cells［J］.Exp Eye Res，2014，118（1）：72⁃79.

［11］NEZAMI M A，HAGER S，GARNER J.EMT and Anti⁃EMT Strategies in Cancer［J］.J Cancer Ther，2015，11（6）：1013⁃1019.

［12］DING X M.MicroRNAs：regulators of cancer metastasis and epi⁃thelial⁃mesenchymal transition（EMT）［J］.Cancer，2014，33（3）：140⁃147.

［13］KOMAI K，NIWA Y，SASAZAWA Y，et al.150 Pirin downregu⁃lates E⁃cadherin gene expression and contributes to EMT［J］.Eur J Cancer，2014，50（6）：51⁃51.

［14］JIN L，CHEN J，LI L，et al.CRH suppressed TGFβ1⁃induced Epithelial⁃Mesenchymal Transition via induction of E⁃cadherin in breast cancer cells［J］.Cell Signal，2014，26（1）：757⁃765.

［15］ABDELBARY E H，RASHED H E，ISMAIL E I，et al.Prognos⁃tic value of cancer stem cell markers CD133，ALDH1 and nu⁃clear β⁃catenin in colon cancer［J］.Chinese⁃German J Clin On⁃col，2014（8）：379⁃385.

［16］MILLER T J，MCCOY M J，HEMMINGS C，et al.The prognos⁃tic value of cancer stem⁃like cell markers SOX2 and CD133 in stageⅢ colon cancer is modified by expression of the immune⁃related markers FoxP3，PD⁃L1 and CD3［J］.Pathology，2017，49（7）：721⁃730.

［17］YU D，ZHANG Y，ZOU Y，et al.Colorectal cancers with aneu⁃ploids show high CD133 expression and poor prognosis［J］.Chi⁃nese⁃German J Clin Oncol，2010，9（10）：601⁃605.

［18］NAKAMURA M，KYO S，ZHANG B，et al.Prognostic impact of CD133 expression as a tumor⁃initiating cell marker in endome⁃trial cancer［J］.Hum Pathol，2010，41（11）：1516⁃1529.