复元胶囊对大鼠膝关节骨性关节炎软骨组织TGF-β1的影响

2018-05-11 01:44邓紫婷周国庆李荣亨
实用中医药杂志 2018年3期
关键词:复元骨关节炎软骨

邓紫婷,周国庆,李荣亨

(1.重庆医科大学附属康复医院,重庆 400050;2.重庆医科大学附属第一医院中西医结合科,重庆 400016)

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是以关节软骨破坏为特点的退行性关节疾病,是在机械性和生物性因素作用下,破坏了关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨的正常合成与降解耦联的结果,多发生在中老年人,是致残的高发性疾病[1]。关节软骨的生长及基质的合成与生长因子密切相关,转化生长因子β1(TGF-β1)是其中之一。TGF-β1是一种多功能细胞因子,广泛参与哺乳动物的各组病理生理过程,研究发现,TGF-β1具有促进骨和软骨细胞增殖、分化和细胞外基质合成的作用。体外研究发现TGF-β1可促进II型胶原的合成,诱导间充质细胞向软骨细胞分化并形成软骨组织。

复元胶囊是治疗骨关节炎的中药复方制剂,治疗OA疗效确切,不良反应少。前期研究显示,复元胶囊通过调节细胞因子、基质金属蛋白酶(MMPS)及其抑制剂(TIMPS)和生长因子之间的平衡[2-4],减少Ⅱ型胶原和蛋白多糖的降解[5],促进细胞增殖,减少细胞凋亡,从而起到防治OA作用[6-7]。本研究通过建立大鼠膝关节骨性关节炎模型,观察不同浓度的复元胶囊对关节软骨中TGF-β1表达的影响,探讨复元胶囊能否通过上调TGF-β1表达,促进细胞外基质的合成,从而达到防治OA的作用。

1 材 料

动物。雄性8周龄SD大鼠60只,体质量(200±10)g,由重庆医科大学动物实验中心提供,实验动物生产许可证号SYSK2002007。

药品。复元胶囊为重庆希尔安药业公司生产(渝卫2002[42-33]),由黄芪、人参、川芎、丹参、淫羊藿、鹿角胶、肉苁蓉、骨碎补、枸杞子等组成,每粒0.41g,每1g含生药3g;抗骨增生胶囊为江苏康缘股份有限公司生产(生产批号110402)。

主要试剂。TGF-β1多克隆抗体购于北京鼎国昌盛技术有限公司,SABC试剂盒及DAB显色剂购于武汉博士德生物工程有限公司,软骨总提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒及2X Es Taq MasterMix(含染料)均来自于北京康为世纪,TGF-β1及内参GAPDH引物由TakaRa公司合成。

仪器。BX50型光学显微镜来自日本OLYMPUS公司,DNA engine PT-200 PCR仪和BIO-RAD凝胶成像仪来自美国BIORAD公司。

2 方 法

分组及造模。60只大鼠随机分为正常组,模型组,抗骨增生胶囊组,复元胶囊低、中、高剂量组各10只。Hulth法[8]建立OA模型,用10%水合氯醛按照0.3mL/100g腹腔注射麻醉大鼠,在无菌条件下切断大鼠右膝关节内侧副韧带,完整切除内侧半月板及剪断前后交叉韧带逐层缝合,无菌包扎。术后给予肌注青霉素抗感染,共7天。术后1周开始每天驱赶大鼠跑步30min,共驱赶8周。正常组大鼠不给予任何处理。

给药。依据Meeh-Rubner公式计算大鼠的等效给药剂量,复元胶囊低、中、高剂量组分别给予复元胶囊371.65、743.30、2229.90mg/(kg·d),抗骨增生胶囊组给予抗骨增生胶囊557.00mg/(kg·d),均配置成3mL溶液,正常组和模型组给予生理盐水灌胃,于术后第2周开始,每天灌胃1次,共8周。

大体观察及光镜观察关节软骨细胞及细胞外基质。于治疗后第8周处死各组大鼠共60只,观察并记录关节囊、滑膜、关节软骨及关节液的一般情况,并于光学显微镜下观察膝关节关节软骨的情况,按Pelletier-JP标准进行评分。取胫骨平台全层软骨连同软骨下骨标本,将其中一部分放置在-80℃冰箱保存,一部分在4%多聚甲醛溶液中固定24h,10%EDTA脱钙15天,常规石蜡包埋,切片H E染色观察软骨组织结构、细胞数量和潮线的完整性。依据Mankin’s法[9]评分标准进行评分,0级为正常,1级为表层破坏,2级为血管翳及表层破坏,3级为浅层裂隙形成,4级为局限性深达骨质的裂隙,5级为大面积深达骨质的软骨缺如,6级为负重区软骨全部丢失。

免疫组化法检测关节软骨中TGF-β1的蛋白表达。切片脱蜡至水,3%H2O2室温15min灭活内源性过氧化物酶。冲洗后PBS浸泡5min,胰蛋白酶消化液修复抗原活性20min,正常山羊血清封闭,滴加1∶50的稀释兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体,4℃孵育过夜。PBS冲洗5min,3次。滴加生物素标记的二抗(武汉博士德),37℃孵育30min,PBS冲洗5min,3次。滴加SABC-HRP(武汉博士德),37℃孵育30min。PBS冲洗5min,3次。二甲苯联苯胺(DAB)室温下显色至满意,自来水终止反应。苏木素复染3min,洗去多余染液,盐酸酒精分化2s,碳酸锂复染1min,酒精梯度脱水后封片,显微镜下观察。图像分析:每个标本取5张切片,每张切片OLYMPUS BX50显微镜下放大200倍,随机取5个视野,采用Image-Pro Plus图像分析软件测定阳性染色平均累积光密度(IOD)。

关节软骨总RNA提取和半定量RT-PCR检测TGF-β1的mRNA表达。取损伤区软骨30mg在液氮中研磨成粉末,然后用TRIzon提取总RNA,紫外分光光度计检测样品吸光度(A),A260/A280为1.8~2.0。每组取1μL总RNA逆转录为cDNA(dNTP Mix,2.5mM Each 4u、Primer Mix 2μL、RNA Template 2μL、5×RT Buffer 4μL、DTT,0.1M、HiFi-MmLV,200U/μL,1μL、RNasefree Water 5μL)。取cDNA1ul进行PCR扩增。其中TGF-β1引物序列为F(5'ATGGTGGACCGCAACAAC3'),R(5'GAGCACTGAAGCGAAAGC3');反应条件为变性94℃30s,退火58.6℃30s,延伸72℃30s,共30个循环,72℃延伸5min。GAPDH引物序列为F(5' GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT3');R(5'GTGGAAGAATGGGAGTTGCTGT3');反应条件为变性94℃30s,退火58.5℃30s,延伸72℃45s,共30个循环,72℃延伸5min。扩增完毕后取5ul产物于含50ul/LGoldViewTM核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶中电泳,用BRORAD凝胶图像分析软件检测各组目的基因及内参的光密度值。

用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,计量资料以(±s)表示、用t检验。

3 结 果

各组大鼠一般情况。造膜过程中动物无死亡,术后无感染,健康状况良好,术后模型组及治疗组,局部刺激有疼痛反应,患肢收缩痉挛,后肢跛行明显,蹬地力量减弱,伴有关节不稳,有异常活动度,1周后消失,8周后关节畸形肿大,正常组关节外部结构正常,无肿胀,活动自如。

大体形态观察见表1。正常组关节面平整光滑,呈淡蓝色,色泽明亮,无裂纹及软化,滑膜无增生,关节液清凉透明,模型组病理改变明显,软骨面糜烂,颜色灰暗,失去光泽,软骨边缘增生明显,多数标本可见大小不等的溃疡,并深达骨质,软骨下骨暴露,滑膜不同程度增生粘连,关节液增多、混浊。复原胶囊高、中剂量组及抗骨增生组软骨面稍粗糙,颜色淡黄,软骨边缘有增生,部分有裂纹及小溃疡出现,滑膜可见少许增生,关节液略增多。

评分标准:0分为关节面透明光整,色泽正常;1分为关节面粗糙,有裂隙,色泽灰暗;2分为关节面糜烂,软骨缺损深达软骨表层和中层;3分为关节面溃疡形成,缺损深达软骨深层;4分为软骨剥脱,软骨下骨暴露。各组膝关节软骨退化评分见表1。

表1 各组膝关节软骨退变程度评分比较 (只)

HE染色后观察软骨组织见表2。正常组软骨组织软骨表层光滑平整,细胞排列整齐,基质染色均匀,潮线清晰;模型组软骨组织层变薄,表层有裂隙,细胞数目变少,排列紊乱,潮线严重断裂模糊;抗骨增生胶囊组软骨表面欠光整,细胞层数明显增多,排列稍紊乱,潮线少许断裂;复元胶囊低剂量组表层裂隙形成,细胞数目减少,排列紊乱,隐窝出现空泡样改变,潮线紊乱;复元中剂量组染色均匀,细胞层增生,细胞数目增多;复元高剂量组表层尚且光滑平整,细胞有明显增生,中深层有少量细胞簇聚,可见双重潮线。

免疫组化法检测软骨组织中TGF-β1表达见表2。正常组软骨在表层见少许阳性细胞;模型组及其余各组软骨组织见不同程度着色,软骨细胞的胞浆及胞核中可见黄色颗粒着色;复元胶囊中剂量组和高剂量组与模型组比较,TGF-β1的表达有明显增加,尤其以复元胶囊高剂量组最为显著。

表2 8周各组大鼠关节软骨Mankin评分及软骨组织中TGF-β1的表达 (IOD,±s)

表2 8周各组大鼠关节软骨Mankin评分及软骨组织中TGF-β1的表达 (IOD,±s)

注:与正常组比较,*P<0.01;与模型组比较,△P<0.01;与模型组比较,#P<0.05;与抗骨增生组比较,□P<0.05。

组别 只 Mankin评分 TGF-β1正常组 10 0.34±0.06 0.63±0.017模型组 10 7.3±0.45* 0.34±0.017*抗骨增生胶囊组 10 3.9±0.73△ 0.68±0.038#复元胶囊低剂量组 10 5.4±0.48△ 0.42±0.031#复元胶囊中剂量组 10 3.8±0.6△ 0.94±0.018△复元胶囊高剂量组 10 2.1±0.53△□ 1.31±0.043△□

RT-PCR法测定软骨组织中TGF-β1的mRNA表达见图2。各组软骨组织提取的RNA经逆转录和扩增后,电泳显示强弱不等的荧光。经图像软件分析结果显示,模型组TGF-β1表达显著降低,与其余各组比较,差异有统计学意义(P<0.01);与抗骨增生胶囊组比,复元胶囊高剂量组TGF-β1的mRNA的表达量增加,差异有统计学意义(P<0.05),而复元胶囊低剂量组和中剂量组表达无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05)。

4 讨 论

骨关节炎以其高发病率及高致残率而受到医学界的广泛关注,且其疗效不显著也成为了国内外研究的热点。骨关节炎的主要临床表现为关节疼痛、关节畸形及功能障碍,目前治疗OA,主要包括基础治疗、药物治疗、传统治疗、物理治疗、关节腔注药和冲洗、外科手术,以及软骨移植、基因治疗、生物治疗、软骨膜和骨膜移植等新疗法。外科手术治疗痛苦大且费用高昂,新疗法尚处起步阶段,有待于进一步研究。为提高广大骨关节炎患者的生活质量,寻找一种经济、安全、易行的治疗方法是非常重要的[10-11]。

骨关节炎属中医“骨痹”范畴。病因病机为气血不足,肝肾亏虚,风寒湿侵入骨髓,痹阻经络导致筋骨失养。证属肝肾亏虚,气滞血瘀。治以补肾壮骨,益气活血为主。复元胶囊中人参、黄芪益气活血,具有抗疲劳、抗缺氧、增强机体适应能力的作用。川芎、丹参行气活血,其有效成分川芎嗪和阿魏酸有改善微循环的作用,且有研究表明川芎嗪能有效防治骨关节炎。鹿茸、淫羊藿补肾壮阳、强筋健骨,有调节免疫和促性腺激素样作用,且性激素有促进软骨细胞增殖的作用[12]。

实验结果显示,TGF-β1在正常组有适量表达,而在模型组TGF-β1表达降低;与模型组比较,复元胶囊各组和抗骨增生胶囊组TGF-β1的表达有明显增加,以复元高剂量组增加最为显著,提示复元胶囊高剂量组疗效优于抗骨增生胶囊组。

通过测定软骨组织中TGF-β1的表达水平证实,复元胶囊能够通过上调TGF-β1的表达,促进软骨细胞和细胞外基质的增生,从而减轻关节软骨的损伤,延缓OA的发展进程。

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