复元胶囊对大鼠膝关节骨性关节炎软骨组织TGF-β1的影响

邓紫婷，周国庆，李荣亨

（1.重庆医科大学附属康复医院，重庆 400050；2.重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆 400016）

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是以关节软骨破坏为特点的退行性关节疾病，是在机械性和生物性因素作用下，破坏了关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨的正常合成与降解耦联的结果，多发生在中老年人，是致残的高发性疾病［1］。关节软骨的生长及基质的合成与生长因子密切相关，转化生长因子β1（TGF-β1）是其中之一。TGF-β1是一种多功能细胞因子，广泛参与哺乳动物的各组病理生理过程，研究发现，TGF-β1具有促进骨和软骨细胞增殖、分化和细胞外基质合成的作用。体外研究发现TGF-β1可促进II型胶原的合成，诱导间充质细胞向软骨细胞分化并形成软骨组织。

复元胶囊是治疗骨关节炎的中药复方制剂，治疗OA疗效确切，不良反应少。前期研究显示，复元胶囊通过调节细胞因子、基质金属蛋白酶（MMPS）及其抑制剂（TIMPS）和生长因子之间的平衡［2-4］，减少Ⅱ型胶原和蛋白多糖的降解［5］，促进细胞增殖，减少细胞凋亡，从而起到防治OA作用［6-7］。本研究通过建立大鼠膝关节骨性关节炎模型，观察不同浓度的复元胶囊对关节软骨中TGF-β1表达的影响，探讨复元胶囊能否通过上调TGF-β1表达，促进细胞外基质的合成，从而达到防治OA的作用。

1 材 料

动物。雄性8周龄SD大鼠60只，体质量（200±10）g，由重庆医科大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号SYSK2002007。

药品。复元胶囊为重庆希尔安药业公司生产（渝卫2002［42-33］），由黄芪、人参、川芎、丹参、淫羊藿、鹿角胶、肉苁蓉、骨碎补、枸杞子等组成，每粒0.41g，每1g含生药3g；抗骨增生胶囊为江苏康缘股份有限公司生产（生产批号110402）。

主要试剂。TGF-β1多克隆抗体购于北京鼎国昌盛技术有限公司，SABC试剂盒及DAB显色剂购于武汉博士德生物工程有限公司，软骨总提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒及2X Es Taq MasterMix（含染料）均来自于北京康为世纪，TGF-β1及内参GAPDH引物由TakaRa公司合成。

仪器。BX50型光学显微镜来自日本OLYMPUS公司，DNA engine PT-200 PCR仪和BIO-RAD凝胶成像仪来自美国BIORAD公司。

2 方 法

分组及造模。60只大鼠随机分为正常组，模型组，抗骨增生胶囊组，复元胶囊低、中、高剂量组各10只。Hulth法［8］建立OA模型，用10%水合氯醛按照0.3mL/100g腹腔注射麻醉大鼠，在无菌条件下切断大鼠右膝关节内侧副韧带，完整切除内侧半月板及剪断前后交叉韧带逐层缝合，无菌包扎。术后给予肌注青霉素抗感染，共7天。术后1周开始每天驱赶大鼠跑步30min，共驱赶8周。正常组大鼠不给予任何处理。

给药。依据Meeh-Rubner公式计算大鼠的等效给药剂量，复元胶囊低、中、高剂量组分别给予复元胶囊371.65、743.30、2229.90mg/（kg·d），抗骨增生胶囊组给予抗骨增生胶囊557.00mg/（kg·d），均配置成3mL溶液，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，于术后第2周开始，每天灌胃1次，共8周。

大体观察及光镜观察关节软骨细胞及细胞外基质。于治疗后第8周处死各组大鼠共60只，观察并记录关节囊、滑膜、关节软骨及关节液的一般情况，并于光学显微镜下观察膝关节关节软骨的情况，按Pelletier-JP标准进行评分。取胫骨平台全层软骨连同软骨下骨标本，将其中一部分放置在-80℃冰箱保存，一部分在4%多聚甲醛溶液中固定24h，10%EDTA脱钙15天，常规石蜡包埋，切片H E染色观察软骨组织结构、细胞数量和潮线的完整性。依据Mankin’s法［9］评分标准进行评分，0级为正常，1级为表层破坏，2级为血管翳及表层破坏，3级为浅层裂隙形成，4级为局限性深达骨质的裂隙，5级为大面积深达骨质的软骨缺如，6级为负重区软骨全部丢失。

免疫组化法检测关节软骨中TGF-β1的蛋白表达。切片脱蜡至水，3%H2O2室温15min灭活内源性过氧化物酶。冲洗后PBS浸泡5min，胰蛋白酶消化液修复抗原活性20min，正常山羊血清封闭，滴加1∶50的稀释兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体，4℃孵育过夜。PBS冲洗5min，3次。滴加生物素标记的二抗（武汉博士德），37℃孵育30min，PBS冲洗5min，3次。滴加SABC-HRP（武汉博士德），37℃孵育30min。PBS冲洗5min，3次。二甲苯联苯胺（DAB）室温下显色至满意，自来水终止反应。苏木素复染3min，洗去多余染液，盐酸酒精分化2s，碳酸锂复染1min，酒精梯度脱水后封片，显微镜下观察。图像分析：每个标本取5张切片，每张切片OLYMPUS BX50显微镜下放大200倍，随机取5个视野，采用Image-Pro Plus图像分析软件测定阳性染色平均累积光密度（IOD）。

关节软骨总RNA提取和半定量RT-PCR检测TGF-β1的mRNA表达。取损伤区软骨30mg在液氮中研磨成粉末，然后用TRIzon提取总RNA，紫外分光光度计检测样品吸光度（A），A260/A280为1.8～2.0。每组取1μL总RNA逆转录为cDNA（dNTP Mix，2.5mM Each 4u、Primer Mix 2μL、RNA Template 2μL、5×RT Buffer 4μL、DTT，0.1M、HiFi-MmLV，200U/μL，1μL、RNasefree Water 5μL）。取cDNA1ul进行PCR扩增。其中TGF-β1引物序列为F（5'ATGGTGGACCGCAACAAC3'），R（5'GAGCACTGAAGCGAAAGC3'）；反应条件为变性94℃30s，退火58.6℃30s，延伸72℃30s，共30个循环，72℃延伸5min。GAPDH引物序列为F（5' GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT3'）；R（5'GTGGAAGAATGGGAGTTGCTGT3'）；反应条件为变性94℃30s，退火58.5℃30s，延伸72℃45s，共30个循环，72℃延伸5min。扩增完毕后取5ul产物于含50ul/LGoldViewTM核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用BRORAD凝胶图像分析软件检测各组目的基因及内参的光密度值。

用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，计量资料以（±s）表示、用t检验。

3 结 果

各组大鼠一般情况。造膜过程中动物无死亡，术后无感染，健康状况良好，术后模型组及治疗组，局部刺激有疼痛反应，患肢收缩痉挛，后肢跛行明显，蹬地力量减弱，伴有关节不稳，有异常活动度，1周后消失，8周后关节畸形肿大，正常组关节外部结构正常，无肿胀，活动自如。

大体形态观察见表1。正常组关节面平整光滑，呈淡蓝色，色泽明亮，无裂纹及软化，滑膜无增生，关节液清凉透明，模型组病理改变明显，软骨面糜烂，颜色灰暗，失去光泽，软骨边缘增生明显，多数标本可见大小不等的溃疡，并深达骨质，软骨下骨暴露，滑膜不同程度增生粘连，关节液增多、混浊。复原胶囊高、中剂量组及抗骨增生组软骨面稍粗糙，颜色淡黄，软骨边缘有增生，部分有裂纹及小溃疡出现，滑膜可见少许增生，关节液略增多。

评分标准：0分为关节面透明光整，色泽正常；1分为关节面粗糙，有裂隙，色泽灰暗；2分为关节面糜烂，软骨缺损深达软骨表层和中层；3分为关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层；4分为软骨剥脱，软骨下骨暴露。各组膝关节软骨退化评分见表1。

表1 各组膝关节软骨退变程度评分比较 （只）

HE染色后观察软骨组织见表2。正常组软骨组织软骨表层光滑平整，细胞排列整齐，基质染色均匀，潮线清晰；模型组软骨组织层变薄，表层有裂隙，细胞数目变少，排列紊乱，潮线严重断裂模糊；抗骨增生胶囊组软骨表面欠光整，细胞层数明显增多，排列稍紊乱，潮线少许断裂；复元胶囊低剂量组表层裂隙形成，细胞数目减少，排列紊乱，隐窝出现空泡样改变，潮线紊乱；复元中剂量组染色均匀，细胞层增生，细胞数目增多；复元高剂量组表层尚且光滑平整，细胞有明显增生，中深层有少量细胞簇聚，可见双重潮线。

免疫组化法检测软骨组织中TGF-β1表达见表2。正常组软骨在表层见少许阳性细胞；模型组及其余各组软骨组织见不同程度着色，软骨细胞的胞浆及胞核中可见黄色颗粒着色；复元胶囊中剂量组和高剂量组与模型组比较，TGF-β1的表达有明显增加，尤其以复元胶囊高剂量组最为显著。

表2 8周各组大鼠关节软骨Mankin评分及软骨组织中TGF-β1的表达 （IOD，±s）

表2 8周各组大鼠关节软骨Mankin评分及软骨组织中TGF-β1的表达 （IOD，±s）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05；与抗骨增生组比较，□P＜0.05。

组别 只 Mankin评分 TGF-β1正常组 10 0.34±0.06 0.63±0.017模型组 10 7.3±0.45* 0.34±0.017*抗骨增生胶囊组 10 3.9±0.73△ 0.68±0.038#复元胶囊低剂量组 10 5.4±0.48△ 0.42±0.031#复元胶囊中剂量组 10 3.8±0.6△ 0.94±0.018△复元胶囊高剂量组 10 2.1±0.53△□ 1.31±0.043△□

RT-PCR法测定软骨组织中TGF-β1的mRNA表达见图2。各组软骨组织提取的RNA经逆转录和扩增后，电泳显示强弱不等的荧光。经图像软件分析结果显示，模型组TGF-β1表达显著降低，与其余各组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；与抗骨增生胶囊组比，复元胶囊高剂量组TGF-β1的mRNA的表达量增加，差异有统计学意义（P＜0.05），而复元胶囊低剂量组和中剂量组表达无明显改变，差异无统计学意义（P＞0.05）。

4 讨 论

骨关节炎以其高发病率及高致残率而受到医学界的广泛关注，且其疗效不显著也成为了国内外研究的热点。骨关节炎的主要临床表现为关节疼痛、关节畸形及功能障碍，目前治疗OA，主要包括基础治疗、药物治疗、传统治疗、物理治疗、关节腔注药和冲洗、外科手术，以及软骨移植、基因治疗、生物治疗、软骨膜和骨膜移植等新疗法。外科手术治疗痛苦大且费用高昂，新疗法尚处起步阶段，有待于进一步研究。为提高广大骨关节炎患者的生活质量，寻找一种经济、安全、易行的治疗方法是非常重要的［10-11］。

骨关节炎属中医“骨痹”范畴。病因病机为气血不足，肝肾亏虚，风寒湿侵入骨髓，痹阻经络导致筋骨失养。证属肝肾亏虚，气滞血瘀。治以补肾壮骨，益气活血为主。复元胶囊中人参、黄芪益气活血，具有抗疲劳、抗缺氧、增强机体适应能力的作用。川芎、丹参行气活血，其有效成分川芎嗪和阿魏酸有改善微循环的作用，且有研究表明川芎嗪能有效防治骨关节炎。鹿茸、淫羊藿补肾壮阳、强筋健骨，有调节免疫和促性腺激素样作用，且性激素有促进软骨细胞增殖的作用［12］。

实验结果显示，TGF-β1在正常组有适量表达，而在模型组TGF-β1表达降低；与模型组比较，复元胶囊各组和抗骨增生胶囊组TGF-β1的表达有明显增加，以复元高剂量组增加最为显著，提示复元胶囊高剂量组疗效优于抗骨增生胶囊组。

通过测定软骨组织中TGF-β1的表达水平证实，复元胶囊能够通过上调TGF-β1的表达，促进软骨细胞和细胞外基质的增生，从而减轻关节软骨的损伤，延缓OA的发展进程。

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