老年大鼠海马TLR4通路在胫骨手术导致的术后认知功能障碍中的作用研究

何 毅， 于婵娟， 刘亚华

(新疆医科大学附属肿瘤医院麻醉科， 乌鲁木齐 830011)

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是患者术后常见的中枢神经系统(central nervous system，CNS)并发症之一，目前机制尚不清楚[1]。手术创伤可激活多种免疫细胞，如树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等。这些免疫细胞释放的炎性因子导致过度的神经炎症反应，从而影响神经递质的合成，突触可塑性或产生神经毒性，并造成认知功能障碍[2]。Toll样受体是模式识别受体中的一类，可以识别不同的病原相关分子模式而启动相应的免疫应答；Toll样受体4(TLR4)信号通路的关键蛋白为核转录因子-κB(NF-κB蛋白)、生存素(Survivin)蛋白[3]。本研究拟观察大鼠行胫骨骨折手术后行为学改变，外周血中炎性介质水平变化与海马区TLR4通路关键蛋白的表达量，为防治术后认知功能障碍提供实验学基础。

1 材料与方法

1.1实验材料老年(>20月)健康雄性Wistar大鼠20只，鼠龄(22±1)月，体质量(550±92)g(北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2014-0004)。水迷宫设备(上海欣软信息科技有限公司)，七氟醚(规格：每瓶120 mL，批号：20150809，江苏恒瑞制药有限公司)，低温离心机(美国Beckman公司)，低温冰箱(日本HITACHI公司)，96孔酶标板(长沙晶美公司)，酶标仪(芬兰LABSYSTEMS公司)，酶标洗板机(芬兰LABSYSTEMS公司)，酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，3,3′,5,5′-四甲基联苯胺二盐酸(TMB)底物反应溶液12 mL(美国R&D公司)，生存素(Survivin)、NF-κB(Santa Cruz)羊抗鼠二抗(武汉博士德)。

1.2方法

1.2.1 POCD模型的建立 将Wistar大鼠随机分为对照组与手术组(每组10只)。保持饲养环境清洁与干燥，12 h昼夜生活，相对湿度(45±5)%，室温维持在(25±2)℃。对2组大鼠进行3 d的Morris水迷宫(MWM)训练，使2组大鼠在MWM中达到同质性[4-6]。记录大鼠的逃避潜伏期时间、寻找平台路径的游泳长度、游泳速度以及在第3象限停留的时间。第4天，对手术组老年大鼠行胫骨骨折内固定术。先对手术组大鼠行七氟醚麻醉，根据大鼠是否活动及对疼痛的反应判断麻醉深度，适时追加麻醉药剂量，后在胫骨中点处切开皮肤及分离皮下组织，用骨剪横向剪断胫骨，随后放置髓内钉固定，逐层缝合。术后给予腹腔内注射丁丙诺啡0.05～0.1 mg/kg进行术后镇痛，对照组老年大鼠仅行麻醉、镇痛处理。于术后1～5 d的相同时间点再次行MWM测试，并记录相关数据。

1.2.2 术后老年大鼠外周血白介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达量的检测 分别于术前1天、术后1、3、5 d早晨9点空腹采集大鼠血液，采血时取老年大鼠尾正中静脉血2 mL，静置30 min，以4 000 r/min离心10 min，取上清液，放入-80℃冰箱中备用。每份上清液被平均分成3份，采用ELISA法检测IL-1β、IL-10和TNF-α水平，操作流程严格按试剂盒说明书进行。

1.2.3 Western blotting法测定海马NF-κB蛋白、Survivin蛋白表达量 术后第5天，于MWM测试后,2组大鼠断头取海马组织，剪碎，加入0.25%的胰酶15 min，然后给予3 mg/mL的I型胶原酶，2～3 h后，以3 500 r/min离心3 min。使用细胞过滤器过滤后，放入离心机中，以9 000 r/min离心5 min，取其上清液，冷藏备用。将收集到的上清液，加入裂解液于4℃静置2 h后，以3 000 r/min离心15 min，取上清液。用 Bradford 法测定蛋白浓度，用BCA法进行蛋白定量后浓度均一化，取35 μg蛋白12%SDS-PAGE电泳，转膜。用5%脱脂牛奶常温摇床封闭2 h后PBS洗涤，加入HPR标记羊抗鼠IgG (1∶5 000稀释)，室温下孵育45 min，PBST洗涤。用ECL发光显色检测蛋白表达；Quantity One软件进行相对定量分析。

2 结果

2.1POCD模型的建立手术组大鼠在不同时点的逃避潜伏期所需的时间无明显改变，与同时点的对照组大鼠相比，手术组大鼠术后3～5 d逃避潜伏期所需的时间明显延长(P<0.05)；在测试游泳路径方面，术后第3天手术组大鼠寻找平台所需的游泳路径与对照组相比明显延长(P<0.05)，术后第4、5天，虽然手术组大鼠寻找平台所需的游泳路径与前3 d比较有所减少，但仍长于对照组(P<0.05)；在术后第1～5天，2组大鼠寻找平台的游泳速度比较无差异，说明大鼠行为学的改变与游泳速度无关。在空间探索能力上，对照组大鼠在第3象限的停留时间为(31.2±5.5)s，手术组大鼠在第3象限停留时间为(17.0±2.9)s，较前者明显缩短(P<0.05),见表1。

2.2手术对老年大鼠外周血炎性因子表达量的影响手术组IL-1β、IL-10和TNF-α在术后1、3、5 d 先升高再逐渐减低，第1天和3天均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，第5天较对照组无差异(P>0.05)。对照组各时间点比较无差异(P>0.05),见表2。

表1 2组大鼠逃避潜伏期时间、游泳路径及游泳速度

注：与对照组比较，*P<0.05。

表2 2组IL-1β、IL-10、TNF-α在血液中表达的含量测定值

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3手术对大鼠海马NF-κB蛋白、Survivin蛋白表达量的影响术后第5天，用Western blotting法测得2组大鼠的海马组织中NF-κB蛋白、Survivin蛋白印迹表达如图1，通过灰度值比较，手术组NF-κB、Survivin含量均降低。对照组与手术组中NF-κB蛋白含量分别为(0.084±0.005)、(0.056±0.003)(P<0.05)，Survivin蛋白含量分别为(0.230±0.02)、(0.174±0.006)(P<0.05)，提示TLR4下游通路可能被抑制。

3 讨论

POCD的发生率很高，在老年病人群体中尤为明显[7]，对其机制进行深入探讨具有重要的社会价值和经济意义[8]。POCD的发生、发展可由多种因素协同造成，比如高血压、药物滥用、过度饮酒[9]、精神因素等。研究表明[10]，外周炎性因子的表达量增加，通过特定途径进入CNS，特别是海马区，会导致长时程增强减弱，破坏突触的可塑性，从而引发认知功能减退。在本实验中，我们发现，与对照组大鼠相比，手术组大鼠术后外周血的IL-1β、IL-10、TNF-α的含量增加。而这些炎症因子表达量的增加与大鼠术后行为学的减退一致，同时伴随海马内TLR4通路关键蛋白NF-κB蛋白、Survivin蛋白的表达量降低。由此推测，手术创伤产生的炎症因子通过抑制海马TLR4信号通路的相关蛋白标记物表达，引发并加重中枢炎症，与POCD的发生发展密切相关。

TLR4作为参与天然免疫的模式识别受体，能识别组织损伤后释放的内源性分子，启动下游一系列通路，并表达多种炎性因子，在炎症中发挥重要作用[11]。TLR4广泛分布于单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞以及中枢的小胶质细胞。在本实验中，手术创伤引发外周血释放大量的炎性物质(IL-1β、IL-10、TNF-α)，这些炎症因子通过血脑屏障进入CNS后引起POCD，同时反馈性抑制了TLR4通路相关蛋白的表达。由于大鼠术后出现了明显行为学的改变，因此推测POCD可能与老年大鼠海马TLR4通路被抑制有关。

在本研究中，老年大鼠在术中可能存在缺氧、低血压等问题，而这些因素亦是POCD发生的危险因素。另外，我们摘取的是术后第5天的大鼠海马组织，无法检测术后1天、3天海马区NF-κB蛋白、Survivin蛋白的表达量，从而不能显示这两个蛋白的动态变化过程。最后，若能直接检测海马区TLR4的蛋白表达量，结果则更加具有说服力。

综上所述，胫骨手术引发的外周炎症介质释放通过抑制TLR4通路关键蛋白NF-κB和Survivin蛋白的表达化来引发POCD。

参考文献：

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