结核感染T细胞斑点实验在结核病诊断中的价值

徐 茜， 贺家勇， 常 炜， 甫拉提·热西提， 王 松

(1新疆医科大学基础医学院免疫学教研室, 乌鲁木齐 830011; 2中国石油乌鲁木齐石油化工总厂职工医院外一科, 乌鲁木齐 830019;3新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院, 乌鲁木齐 830054; 4新疆维吾尔自治区胸科医院胸外中心， 乌鲁木齐 830049)

据世界卫生组织估算，全世界感染结核分支杆菌占1/3的人口，每年新增有结核病患者800万例，其中死亡200万例[1]。结核病早期诊断和治疗是控制结核传播的关键[2]。结核菌素试验(PPD)是目前临床常常采用诊断结核的方法之一，但结核菌素与卡介苗会存在交叉免疫源性，会产生交叉免疫反应，其在结核病中的诊断价值存在局限性。在活动性肺结核患者中，约有40%～60%的肺结核患者结核菌阴性，因此，采用痰抗酸杆菌的方法诊断比较困难[4-5]。痰结核菌培养是诊断结核病的金标准，但其耗时较长，不能用于早期诊断结核病。结核菌感染T细胞斑点实验(T-SPOT.TB)是γ干扰素释放试验的一种，是近年来产生的新的检测技术[6-7]。本研究分别对60例确诊痰菌种阴性及34例痰菌阳性肺结核患者和30例非结核病，采用3种检测方法，即T-SPOT.TB、结核分枝杆菌DNA测定(TB-DNA)和结核菌素皮试(TST)进行检测，评价与对比T-SPOT.TB在痰菌阴性与痰菌阳性肺结核病中的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1临床资料收集新疆维吾尔自治区胸科医院痰结核杆菌阴性肺结核患者60例(痰菌阴性组)，其中男性33例，女性27例，年龄22～75岁。诊断符合2006年中华医学会结核病学分会制定的“肺结核诊断和治疗指南”中菌阴活动性肺结核诊断标准[3]。患者3次涂片1次培养菌阴性。另纳入痰结核杆菌阳性肺结核患者34例为痰菌阳性组，其中男性18例，女性16例，年龄24～79岁。排除标准：(1)肺结核病复治者或初治患者治疗≥2 w患者；(2)存在获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、肝炎、糖尿病及其他免疫功能异常者；(3)孕妇、哺乳期妇女。另纳入肺癌、慢性阻塞性肺疾病和支气管肺炎患者共35例，为非结核病组，其中男性17例，女性18例，年龄25～81岁。3组患者一般资料中性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性,各组一般资料的比较见表1。

1.2T-SPOT.TB实验方法采用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)行T-SPOT.TB检查。患者入院检查，抽取8 mL外周血，分离外周血单核细胞(PBMC)。试剂盒为英国Oxford Zmmunote公司产品，严格按试剂盒说明书进行试验。配置 250万细胞/mL 的标准溶液。取出微量板，以细胞培养液为阴性对照，阳性对照加入植物血凝素，剩余2孔分别加入50 μL抗原A和抗原B，分别含抗原A(ESAT-6)和抗原B(CFP-10)，每孔加入含有25万PBMC的上述细胞悬液100 μL，将微量板置于CO2培养箱中37℃孵育16～20 h，PBS液洗脱，加入生物标记的抗IFN-γ单克隆抗体50 μL，4℃中孵育2 h，采用PBS液洗脱，酶联显色，记录斑点数。根据抗原A和(或)抗原B的反应孔的斑点数进行判断。阳性、阴性对照孔斑点数为0～5，阳性样本应为[(抗原A或抗原B斑点数)-(阴性对照孔斑点数)]≥ 6；阴性对照孔斑点数≥6，阴性样本应为：(抗原A或抗原B斑点数)≥2×(阴性对照孔斑点数)。

表1 3组一般资料的比较

1.3TST检测方法入院时，于患者前臂皮内注射结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)0.1 mL，72 h后查验结果及卡痕，以硬结直径<5 mm为阴性，硬结直径≥10 mm为阳性。

1.4TB-DNA检测采用RT-PCR技术进行TB-DNA检测，运用定量PCR对TB-DNA进行检测，TB-DNA荧光PCR检测试剂盒由中山大学达安基因公司提供，具体操作参照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1T-SPOT.TB检测结果3组T-SPOT.TB阳性率经比较差异有统计学意义(P<0.05)。肺结核组(包括痰菌阴性组、痰菌阳性组)的T-SPOT.TB阳性率均明显高于非结核组，差异有统计学意义(P<0.05)。痰菌阴性组和痰菌阳性组T-SPOT.TB阳性率差异无统计学意义(χ2=1.207，P=0.272)。痰菌阴性组和非结核组T-SPOT.TB阳性率差异无统计学意义(χ2=38.033，P=1.207)，见表2。

表2 各组患者结核感染T细胞斑点实验(T-SPOT.TB)检测结果

注：痰菌阴性组vs痰菌阳性组(χ2=1.207，P=0.272)；痰菌阴性组vs非肺结核组(χ2=38.033，P=1.207)；痰菌阳性组vs非肺结核组(χ2=35.945，P=0.000)。

2.2单一检测方法对诊断肺结核的价值评价单一指标检测肺结核，T-SPOT.TB的敏感性和特异型分别为88.3%和94.3%，其敏感性高于TST和TB-DNA，经统计分析，差异有统计学意义(P<0.05)；特异性低于TST，而高于TB-DNA，见表3、表4。

表3 肺结核组中T-SPOT.TB、TST和TB-DNA 3种检测方法的结果

注：*T-SPOT.TB与TST、TB-DNA比较的χ2值和P值。

表4 非肺结核病组中T-SPOT.TB、TST和TB-DNA 3种检测方法的结果

注：*T-SPOT.TB与TST、TB-DNA比较的χ2值和P值。

3 讨论

结核的诊断一直受临床医生的关注。近年来，T细胞的γ干扰素释放试验在结核病诊断领域取得重要进展[8-9]，其采用结核杆菌所特有抗原早期分泌抗原靶蛋白(ESAT-6)和培养滤过蛋白-10(CFP-10)刺激机体T细胞释放IFN-γ，T-SPOT.TB是目前IFN-γ体外释放实验诊断结核分枝杆菌感染最主要的办法。T-SPOT.TB应用酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测，经结核特异性抗原ESAT-6和FP-10刺激后外周血单个核细胞IFN-γ分泌，并经一系列反应后比较斑点显示的效果。T-SPOT.TB对于结核的辅助诊断值较高，Lee 等[10]的前瞻性研究结果提示 T-SPOT.TB 诊断结核的敏感性和特异性分别为 96.6%和84.7%。Dai 等[11]通过Meta 分析研究显示，T-SPOT.TB 对结核诊断的敏感性为88%，特异性为 89%。本研究结果显示，T-SPOT.TB对结核诊断的敏感性为88.3%，特异性为94.3%，与上述文献报道相一致。

本研究采用3种方法检测其在结核病检测中的临床应用价值，结果发现，肺结核组(包括痰菌阴性组、痰菌阳性组)的T-SPOT.TB阳性率均明显高于非结核组，T-SPOT TB、TST和TB-DNA在肺结核中的敏感性分别为88.3%、31.9%和69.1%，特异性分为94.3%、100%和91.4%。在3种检测方法中，TST检测的敏感性最低。虽然TST是公认的快速诊断肺结核感染的有效手段，但其检测的敏感性比较低的可能原因为：对于免疫力低下的结核患者，其敏感性会有所降低，所以TST在TB的诊断中也存在一定的局限性。TB-DNA的敏感性、特异性界于TST和T-SPOT.TB之间，TB-DNA的阳性率受制于痰液中结核分枝杆菌数量，容易出现假阳性。另外TB-DNA检测标本来源不如T-SPOT.TB标本源方便易得，对于不咯痰或不能接受支气管镜的患者，不易取得检测标本。T-SPOT.TB在痰菌阳性和阴性标本的阳性检测率分别为85.0%和94.1%，两者差异无统计学意义，可见T-SPOT.TB的敏感性与患者是否排菌、排菌类型及排菌数量多少无关，可以成为结核病早期诊断的辅助检查手段。T-SPOT.TB由于其检测的是外周血中结核特异性释放IFN-γ的淋巴细胞的数量，因而也不会受到个体细菌学检测结果的影响，在肺结核诊断菌阴肺结核中，T-SPOT.TB检测显得更有辅助价值。

肺结核涂阳仅占肺结核发病例数的约50%，涂阴肺结核的诊断及非结核分枝杆菌感染率上升，给T-SPOT.TB提供利用空间，其不仅可节约诊断时间，而且有较高的敏感性、特异性，是较为有效的辅助诊断方法。

需要注意的是，T-SPOT.TB阳性结果不能作为单独或是决定性的诊断结核病的依据，无法诊断潜伏感染和活动性肺结核；除病原学确诊外，结核病的诊断需要结合临床表现、实验室检查、影像学结果进行综合判断。

参考文献:

[1] JASMER R M, NAHID P, HOPEWELL P C. Clinical practice. Latent tuberculosis infection[J]. N Engl J Med, 2002, 347(23):1860.

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[3] 中华医学会．结核病分册[M]．北京：人民卫生出版社，2005:55-58．

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[5] 陈素丽，刘锐．菌阴肺结核诊断[J]．临床荟萃，2016，31(10)：1054-1057．

[6] 程利．T-SPOT.TB检验在活动性肺结核患者中的临床意义[J]．中国医药科学，2016,6(1)：220-222．

[7] 崔中锋，刘春礼，李格，等．T-SPOT.TB在结核性脑膜炎早期诊断中的价值[J]．中国实用神经疾病杂志，2016，19(16)：97-98．

[8] 何玲慧，陈晓琴，傅文．T-SPOT.TB检测技术在临床结核病中的应用进展[J]．医药前沿，2016，6(6)：23-24．

[9] 张林，李琦．γ-干扰素释放试验对HIV感染者合并菌阴肺结核辅助诊断价值的探讨[J]．临床肺科杂志，2016，21(12)：2183-2188．

[10] LEE J Y, CHOI H J, PARK I N, et al. Comparison of two commercial interferon-gamma assays for diagnosing mycobacterium tuberculosis infection[J]. Eur Respir J, 2006, 28(1):24-30.

[11] DAI Y, FENG Y, XU R, et al. Evaluation of interferon-gamma release assays for the diagnosis of tuberculosis:an updated meta-analysis[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2012, 31(11):3127-3137.