骆驼刺单体化合物的制备及其抗人宫颈癌Hela细胞增殖活性的研究

马晓玲， 刘雪松， 魏鸿雁， 韩莉莉

(1新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，乌鲁木齐 830002; 2新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046; 3新疆维吾尔自治区人民医院妇科，乌鲁木齐 830002)

骆驼刺(AlhagisparsifoliaShap)是新疆干旱沙漠地区特有的一种落叶灌木，它也是沙漠戈壁“三宝”之一，具有开通阻滞、止咳祛痰、消除异常黏液质等功效，是用于腹痛腹胀、痢疾腹泻、风湿病、滋补强壮、平衡体液和异常胆液质的常见药方[1]。刺糖是骆驼刺在高温干旱环境中由于抗逆性而分泌的糖粒。课题组对乌鲁木齐市郊和乌鲁木齐以北地区的骆驼刺与吐鲁番托克逊县骆驼刺进行了比较，然而近年来由于乌鲁木齐周边等地气候较温和，其骆驼刺已不产生刺糖[2]。因此，本研究采用吐鲁番地区含刺糖骆驼刺作为研究对象。本研究借鉴本课题组前期发现的骆驼刺提取物抗肿瘤和免疫调节的研究基础[3-6]，为了深入探讨骆驼刺提取物对宫颈癌细胞的影响，通过体外培养人宫颈癌Hela细胞，观察骆驼刺提取物和从中分离得到的化合物对宫颈癌Hela细胞增殖(G2期)的影响，明确骆驼刺中具有抗肿瘤活性的成分，为利用骆驼刺活性成分治疗宫颈癌提供实验依据。

1 资料与方法

1.1试剂与仪器

1.1.1 试剂与药材 DMEM高糖培养基(Hyclone 公司)， 胎牛血清(Gibco 公司，FBS)，0.25%胰酶(Hyclone公司)，PBS 缓冲溶液(Thermo公司， 双抗(青霉素-链霉素 PS)，四甲基偶氮盐(Sigma公司，MTT)，5-氟尿嘧啶(上海旭东海普药业有限公司，5-Fu)，硅胶 G 薄层板，硅胶 GF254 薄层板(青岛海洋化工有限公司)，C18柱色谱(大连江申分离科学技术公司)，ODS 制备型色谱柱(YMC公司)，葡聚糖凝胶色谱柱 (sephadex LH- 20，GE Healthcare Bio-Science AB 公司)，色谱甲醇(美国 fisher scientific，色谱纯)，石油醚，甲醇，乙醇，乙酸乙酯，正丁醇，浓硫酸，二甲基亚砜(DMSO)等试剂均为分析纯(天津市致远化学试剂有限公司)。骆驼刺采自新疆吐鲁番地区，经新疆中药民族药研究所王果平副研究员鉴定其为豆科骆驼刺属植物骆驼刺(AlhagisparsifoliaShap.)。

1.1.2 细胞株 人宫颈癌Hela细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。

1.1.3 仪器 电热真空干燥箱 DZF-2B (北京永光明医疗仪器厂)，旋转蒸发仪 V-100 (上海爱朗仪器有限公司)，冷却水循环装置 CCA-1111 (上海爱朗仪器有限公司)，循环水式多用真空泵 SHB-III (郑州长城科工贸有限公司)，二氧化碳培养箱 BC-J80S (上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，洁净工作台 SW-CJ-2F(苏州尚田洁净技术有限公司)，冷冻离心机 MIKRO 220R (德国Hettich)，酶标仪 BioTeK(上海佛秋乐贸易有限公司)，优普超纯水机 UPT-I-5T/L (成都超纯科技有限公司)，Bruker ARX-300和AV-600型核磁共振仪(德国Bruker Internation AG),高效液相色谱仪(岛津SPD-20A),循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司SHZ-Ⅲ),旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂RE-5210A)。

1.2方法

1.2.1 提取分离 干燥的吐鲁番骆驼刺地上部分(9 kg)，浸泡0.5 h，用70%乙醇回流提取3次(2、1.5、1.5 h)，浓缩得到乙醇提取物(呈浸膏状)1 550 g，乙醇提取物经水分散后(9 L)，分别用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，得石油醚萃取物(22.4 g)，乙酸乙酯萃取物(93.0 g)，正丁醇萃取物(260.0 g)和水相萃取物(346.8 g)。

1.2.2 不同极性萃取物抗Hela细胞增殖活性的筛选[7-8]将细胞从液氮中取出，迅速置于37 ℃水浴锅中解冻，然后吸入离心管，加入3 mL细胞培养液(10%胎牛血清 DMEM 培养液)，1 000 r/min离心 5 min，弃去上清液，将细胞重悬于1 mL细胞培养液，并转移至 10 cm细胞培养皿中，加入5 mL细胞培养液，混匀后放入细胞培养箱进行培养(37℃、5% CO2)。每2天更换1次培养液，观察细胞形态，维持细胞处于对数生长期备用。

取对数生长期的 Hela细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液后细胞计数, 将细胞密度调整为6×104个/mL，铺板，培养24 h后给药。空白对照组给予等体积的 PBS；给药组分别加入培养基配置的不同浓度的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取粗提物，其浓度依次为32、16、8、4、2、1 mg/mL，阳性对照组加入不同浓度的5-FU，每个浓度设 3个复孔，再培养48 h后，加入5 mg/mL的MTT液 (10 μL/孔)4 h后，弃去上清加入DMSO 100 μL/孔。于摇床上震荡5～10 min , 使完全混匀溶解结晶，在酶标仪上于570 nm处测吸光度，每个剂量设平行重复3孔，实验重复3次。按以下公式计算抑制率，拟合后求半抑制浓度(IC50)值。抑制率 =(1-A实验组/A对照组)×100%。

1.2.3 吐鲁番骆驼刺乙酸乙酯萃取物的纯化 取80 g乙酸乙酯萃取物，采用硅胶吸附柱色谱依次用石油醚-乙酸乙酯(100∶0～ 0∶100)进行梯度洗脱，洗脱液经硅胶薄层鉴别后，合并组成相似的馏分，对Fr. 1进行硅胶吸附柱色谱，用石油醚:甲醇做洗脱剂，得到化合物17(5.5 mg)和18(7.8 mg)。对Fr. 2进行硅胶吸附柱色谱，用石油醚：乙酸乙酯(100∶15)作洗脱剂，得到化合物1(400.6 mg)。对Fr. 3进行硅胶吸附柱色谱，用二氯甲烷：甲醇(42∶56)作洗脱剂，得到Fr. 3-1，再对其进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，用二氯甲烷：甲醇洗脱，即得化合物23(13.7 mg)。对Fr. 4进行开放ODS柱色谱，用甲醇：水洗脱，得到Fr. 4-1、Fr. 4-2和Fr. 4-3，再对其采用制备型高效液相色谱进行分离，分别得到化合物10(21.3 mg)，13(5.6 mg)，2(12.3 mg)。对Fr. 5用甲醇洗脱并重结晶得到化合物12(70.5 mg)。对Fr. 6进行开放ODS柱色谱，用甲醇：水洗脱，得到Fr. 6-1，采用制备型高效液相色谱对Fr. 6-1进行分离，得到化合物3(5.6 mg)和4(7.8 mg)。对Fr. 7进行硅胶吸附柱色谱，用二氯甲烷：甲醇作洗脱剂，得到化合物11(500.3 mg)。对Fr. 8进行开放ODS柱色谱，用甲醇：水洗脱，得到Fr. 8-1、Fr. 8-2和Fr. 8-3，在对其采用制备型高效液相色谱进行分离，分别得到化合物16(10.4 mg)，21(13.3 mg)，22(19.4 mg)。

1.2.4 吐鲁番骆驼刺正丁醇萃取物的纯化 取250 g正丁醇萃取物，利用HPD100大孔吸附树脂进行粗分，以不同浓度乙醇-水梯度洗脱，得到30%乙醇-水洗脱物120.0 g，90%乙醇-水洗脱物75.0 g。取90%乙醇-水洗脱物70.0 g，采用硅胶吸附柱色谱，依次用二氯甲烷：甲醇(100:0～0:100)进行洗脱，洗脱液经硅胶薄层鉴别后合并组成相似的流分，对Fr. 1进行开放ODS柱色谱，用甲醇：水洗脱，得到Fr. 1-1和Fr. 1-2，采用制备型高效液相色谱对Fr. 1-1进行分离，得到化合物8(13.4 mg)，9(20.3 mg)，对Fr. 1-2采用制备型高效液相色谱进行分离得到化合物7(5.6 mg)。对Fr. 2用甲醇洗脱并重结晶得到化合物14(600.3 mg)。对Fr. 3进行开放ODS柱色谱用甲醇：水洗脱，得到Fr. 3-1和Fr. 3-2，再对其都采用制备型高效液相色谱进行分离，分别得到化合物5(13.2 mg)和6(12.3 mg)。对Fr. 4进行开放ODS柱色谱用甲醇：水洗脱，得到Fr. 4-1、Fr. 4-2和Fr. 4-3，再对其采用制备型高效液相色谱进行分离，分别得到化合物15(13.4 mg)，19(13.2 mg)和20(13.4 mg)。对Fr. 5进行开放ODS柱色谱用甲醇：水洗脱，得到化合物24(3.0 mg)。

1.2.5 骆驼刺中各单体化合物对Hela细胞的活性筛选 取对数生长期的Hela细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液后细胞计数，将细胞密度调整为6×104个/mL，铺板，培养24 h后给药。空白对照组给予等体积的 PBS；给药组分别加入不同浓度的化合物，其浓度依次为200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL。

1.3统计学处理实验数据采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，采用单因素方差(one way ANOVE)分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1活性筛选

2.1.1 不同极性的骆驼刺提取物 乙酸乙酯部位和正丁醇部位对Hela细胞有明显的抑制作用，其IC50值分别为20.0和16.9 mg/mL，见表1。后续本研究对乙酸乙酯部位和正丁醇部位进行了化合物的分离和活性筛选。

2.1.2 骆驼刺中各单体化合物对Hela细胞的活性筛选 化合物8、15、21、23对Hela细胞增殖有较强的抑制作用，其IC50值分别为44.7、23.1、91.2、41.2 μg/mL，见表2。

表1 不同极性骆驼刺提取物对Hela细胞的抑制率和IC50值

表2 单体化合物的活性筛选

2.2结构鉴定

2.2.1 化合物8 淡黄色针晶 (甲醇) ，1H-NMR(600 Hz，CD3 OD): 7.65(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，6.98(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，6.82(1H，dd，J1=1.8 Hz， J2=7.8 Hz，H-6′), 6.80 (1H，d，J=7.8 Hz，H-5′)， 6.51 (1H，dd，J1=2.4 Hz，J2=8.4 Hz，H-6)，6.36(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，5.35(1H，dd，J1=3.0 Hz，J2=12.6 Hz，H-2)，2.98(1H，dd，J1=12.6 Hz，J2=16. 2 Hz，H-3b)，2.65(1H，dd，J1=2.4 Hz，J2=16. 2 Hz，H-3a);13C-NMR(CD3OD): 190.5 (C=O)，165.2(C-7)，164.4 (C-9)，146.2(C-4′)，145.9(C-3′)，132.0(C-5)， 129.4(C-1′)，119.2(C-6′)，116.0(C-2′)，115.2(C-5′)，114.7(C-6)，111.1(C-8)，103.6(C-10)，80.5(C-2)，44. 7(C-3)。以上光谱数据与文献[9]报道的基本一致，故鉴定化合物8为紫铆素。其结构图见图1。

2.2.2 化合物15 无色针状结晶(甲醇)；三氯化铁 -铁氰化钾反应阳性, 提示结构中存在酚羟基。1H-NMR(300 MHz, CD3 OD):9.68(1H, s, 7-CHO)、7.30 (1H, m, H-6)、7.28(1H, brs, H-2)、6.90 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5)。13C-NMR(75 MHz, CD3 OD):193.1(C-7)、 153.7(C-4)、147.2(C-3)、130.8(C-1)、126.4(C-6)、116.2(C-5)、115.3(C-2)。以上波谱数据与文献[10]对照基本一致，故鉴定化合物15为原儿茶醛,其结构图见图2。

图1紫铆素结构图

图2原儿茶醛结构图

2.2.3 化合物21 白色无定形粉末；Molish反应阳性；TLC FeCl3显红色。ESI-MS m/z 579[M-H]，417[M-H-162]；1H-NMR(500MHZ，CD3OD)δ:6.74(2H，s，2′6′-H)，6.68(2H，s，2″，6″-H)，4.88(1H，m，glc-1-H)，4.79(1H，d，2-H)，4.74(1H，d，6-H)，4.31(1H，dd，4-Ha)，4.30(1H，dd，Hb)，3.93(2H，m，4-Hb，8-Ha)，3.88(6H，s，3″，5″-OMe)，3.86(6H，s，3′，5′-OMe)，3.69(1H，dd，glc-6-Hb)，3.49(1H，dd，glc-6-Ha)，3.15(2H，m，1,5-H)；13C-NMR(500MHz，CD3OD)δ：153.0(C-3′，5′)，148.0(C-3″，5″)，138.2(C-1′)，131.7(C-1″)，104.0(C-2′，6′)，103.5(C-2″，6″)，103.2(C-glc-1),86.2(C-6)，85.8(C-2)，76.9(C-glc-5),76.4(C-glc-,3)，74.(C-glc-2)，71.5(C-4)，71.5(C-8)，70.0(C-glc-4),61.2(C-glc-6),55.7(OMe-3′,5′)，55.5(OMe-3″，5″)，54.3(C-1)，54.1(C-5)。该化合物的波谱数据与参考文献[11]中报道的tortoside A一致，因此鉴定化合物21为tortoside A,其结构图见图3。

图3 tortoside A结构图

2.2.4 化合物23 无色油状物，具有芳香气味；EI-MSm/z 150(M+)；1H-NMR(CDCl3，300 MHz) δ: 6. 72(1H，d，J=1. 5 Hz，H-2)，6.89(1H，dd，J=7.0，1.5Hz，H-6)，6.70(1H， d， J=7.0 Hz， H-5)，4.60(1H，d，J=17.7Hz，H-8a)，4.13 (1H，d，J =10.8 Hz，H-8b) ，3.72(3H，s，3-OMe)，3.69(1H，dd，J=10.8，17.7 Hz，H-7);13C-NMR(CDCl3，75 MHz) δ: 146.6(C-3)，145.6 (C-4)，136.6(C-7)，130.3 (C-1)，120.1(C-6)，114.4(C-8)，111.5 (C-5)， 108.0 (C-2)，55.9(3-OMe)。以上数据与文献[12]报道3-甲氧基-4-乙烯基苯酚(3-methoxy-4-vinylphenol) 的数据一致，因此鉴定化合物23为4-乙烯基3-甲氧基苯酚,其结构图见图4。

图44-乙烯基3-甲氧基苯酚结构图

3 讨论

本研究采用液质联用、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、ODS柱色谱法、和重结晶等技术对骆驼刺中的有效成分进行分离和富集，筛选出抗肿瘤活性组分并进行结构鉴定，可以为骆驼刺活性成分的深入研究提供参考。在活性筛选的研究中，首先利用 MTT法检测各不同极性萃取部位对肿瘤细胞的增殖抑制能力，明确其中的正丁醇和乙酸乙酯部位对Hela细胞具有一定的抑制作用，进而对上述二种部位进行筛选，利用5-FU与骆驼刺中各单体化合物进行比较，发现其中化合物8、15、21和23对Hela细胞增殖有较强的抑制作用(P<0.05)，且呈现一定的剂量依赖性，经鉴定分别为紫铆素，原儿茶醛，tortoside A，4-乙烯基-3-甲氧基苯酚。4种化合物都是首次从骆驼刺属植物中分离的，化合物8、15、21的抗肿瘤作用与文献报道的一致[9，13]，而化合物23的抗肿瘤作用是本研究首次报道。本研究从细胞水平探索了骆驼刺对宫颈癌细胞增殖的影响，而其具体作用机制还有待于进一步探讨。

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