桂枝茯苓胶囊抑制子宫内膜异位症大鼠子宫内膜血管新生

刘明星 许 越 蒋亚玲 欧妙娴

(广州医科大学附属第三医院妇产科，广东 广州 510150)

子宫内膜异位症(EM) 是具有生长功能的内膜细胞在子宫腔内膜以外位置异位生长而形成的一种女性常见妇科疾病〔1，2〕。虽然目前EM的发病机制仍未阐明，EM发生发展有赖于血管生成和充足的血液供应，抗血管生成治疗法已成为治疗研究的新热点〔2，3〕。《金匮要略》指出桂枝茯苓具有活血化瘀之功效，用于妇女血瘀、经闭及恶露等顽疾。本研究观察caveolin-1的表达，探讨桂枝茯苓胶囊对EM大鼠治疗效果和作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 雌性、性成熟SD大鼠80只，体重200～220 g，清洁级，购自广东省医学实验动物中心，饲养于广东省医学实验动物中心。饲养室温20℃～25℃，相对湿度50%～70%，实验动物自由饮水饮食，每日观察动物进食情况，称体重，及时清理粪便。

1.2构建EM大鼠模型〔4〕筛选处于动情期大鼠(经阴道涂片检查)，在造模前夜所有大鼠予以禁食，不禁水，术前对大鼠予以腹腔注射2%戊巴比妥钠实施麻醉(120 mg/kg)，固定大鼠手术台。取腹正中、耻骨联合上2 cm切长2～3 cm切口进腹，取近端离右侧子宫角1 cm处结扎，远端离卵巢1 cm处结扎后切下大鼠子宫，置入无菌生理盐水培养皿中，纵向剖开大鼠子宫分离，取组织剪剪取3块3 mm×5 mm的子宫内膜组织备用。在腹壁切口右侧从腹肌与皮下筋膜层之间剥离，置入子宫内膜片，取1块子宫内膜组织平整置于剥离处底部，动态观察，4 w后模型复制成功。

1.3分组处理 将造模成功的大鼠分为模型对照组、桂枝茯苓胶囊低、高剂量组各20只。桂枝茯苓胶囊低剂量组和高剂量组分别采用0.5、1.5 g/kg桂枝茯苓胶囊进行灌胃治疗；空白对照组和模型对照组则以等量生理盐水灌胃。1次/d，连续28 d，结束治疗后，处死大鼠，摘取异位子宫内膜，将每个标本切为4份，分别用于免疫组织化学和荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测。

1.4免疫组织化学染色与观察 将组织切片至于68℃烤箱30 min，然后进行二甲苯脱蜡处理，梯度酒精脱水：二甲苯孵育5 min，弃去二甲苯，加入新的二甲苯继续孵育5 min，无水乙醇洗涤3 min，无水乙醇Ⅱ洗涤3 min，分别95%、80%乙醇洗涤3 min，而后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次3 min；以柠檬酸钠为修复液，在高压锅内置入载有玻片的盒子进行热修复，加热至沸腾煮5 min后，停止加热，冷却至室温；再予以甲醇-H2O2溶液避光修复15 min，以阻断灭活内源性过氧化物酶对标本的破坏，PBS洗涤3次，每次3 min；按照1∶500的比例加入caveolin-1抗体，对石蜡组织切片进行室温孵育1 h或者4℃孵育过夜，之后用PBS冲洗3次，每次3 min；按照1∶1 000的比例加入辣根过氧化物(HRP)二抗，对石蜡组织切片进行室温孵育40 min，之后用PBS冲洗3次，每次3 min；加入二氨基联苯胺(DAB)试剂盒中的显色剂，室温孵育5～10 min，然后清水冲洗；再进行苏木精复染室温孵育3～5 min，清水冲洗；对染色后的切片进行梯度酒精水化处理，然后树胶封片观察。采用上述同样的操作方法，对组织切片中的血管内皮生长因子(VEGF)进行免疫组织化学染色观察。

1.5荧光定量PCR检测 取各组的组织切片，采用RNA提取试剂盒对各组织切片的RNA进行提取，所有操作严格按照提取试剂盒(天根生化科技有限公司)操作说明书进行。将提取得到的RNA进行体外反转录，采用miScript Ⅱ RT试剂盒(Qiagen公司)操作说明书进行，使用20 μl反应体系进行实验。反转录完成后，将反应液至于-20℃冰箱，以备下步定量PCR实验；以U6为内参，对组织中caveolin-1及VEGF的表达进行荧光定量PCR操作，反应条件如下，预变性：95℃ 30 s，扩增(40个循环)：94℃ 30 s，60℃ 30 s，70℃ 30 s，引物序列caveolin-1上游GGATGAGGATCACTGTTTTG、下游CCATTTGTCCACTGTAATT；VEGF上游AGAGGAAAGAGGTAGCAG、下游CCCAAAAGCAGGTCAGTC；β-actin上游ACCCGCGAGTACAACCTT、下游CATACCCACCATCACACC。

1.6统计学方法 采用SPSS21.0统计软件进行t检验和方差分析，Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1caveolin-1、VEGF蛋白表达染色结果比较 caveolin-1蛋白主要表达在血管内皮细胞中，模型对照组caveolin-1阳性细胞数最少，28 d治疗后，桂枝茯苓胶囊低、高剂量组caveolin-1阳性细胞数增加；VEGF在模型对照组中高表达，细胞阳性率较高，而桂枝茯苓胶囊低、高剂量组VEGF阳性细胞数减少，见图1。

图1 各组caveolin-1、VEGF免疫组织化学染色结果(×400)

2.2caveolin-1表达定量比较 治疗前模型对照组caveolin-1表达显著低于空白对照组(t=13.89，P<0.05)，而与桂枝茯苓胶囊低剂量组和高剂量组差异无统计学意义(F=2.456，P>0.05)；空白对照组及模型对照组治疗前后caveolin-1表达差异无统计学意义(P>0.05)；而桂枝茯苓胶囊低、高剂量组治疗后caveolin-1的表达较治疗前显著升高(P<0.001)，相比于模型对照组差异有统计学意义(P<0.05)，其中桂枝茯苓胶囊高剂量组caveolin-1的表达水平显著高于低剂量组(t=9.269，P<0.05)。见表1。

表1 各组治疗前后caveolin-1、VEGF相对表达比较

与模型对照组比较:1)P<0.05；与空白对照组比较：2)P<0.05；与桂枝茯苓胶囊低剂量组比较：3)P<0.05

2.3VEGF表达定量比较 治疗前模型对照组VEGF的表达显著高于空白对照组(t=14.84，P<0.05)，而与桂枝茯苓胶囊低、高剂量组差异无统计学意义(F=0.014，P>0.05)；空白对照组及模型对照组治疗前后、VEGF表达差异无统计学意义(P>0.05)；而桂枝茯苓胶囊低、高剂量组治疗后、VEGF表达较治疗前显著下降(P<0.001)，其中桂枝茯苓胶囊中高剂量组VEGF表达水平显著低于低剂量组(t=3.141，P<0.05)。见表2。

2.4caveolin-1与VEGF表达相关性 caveolin-1与VEGF表达水平呈显著负相关(r低剂量组=-0.65，P<0.05；r高剂量组=-0.61，P<0.05)，随着caveolin-1表达水平的提高，VEGF的表达逐渐降低，见图2。

图2 桂枝茯苓胶囊低、高剂量组caveolin-1与VEGF的表达相关性

3 讨 论

EM发生发展过程中新生血管的形成不仅能为异位病灶提供充足的氧气，还可以维持其营养物质的供应，因而血管生成是异位病灶形成的重要条件〔5〕。血管生成是指从机体已存在的血管组织上产生新血管的动态过程，其中涉及多种细胞因子和生长因子参与调控，主要过程包括血管内皮细胞的增殖、迁移及分化过程等〔6，7〕。caveolin-1是内皮细胞的内源性蛋白，在内皮细胞中表达量较高，其在血管生成中的作用得到了广泛的研究〔8，9〕。细胞周期分析证实高表达caveolin-1可以抑制VEGF引起的人脐静脉内皮细胞增殖。实验动物研究显示caveolin-1与肿瘤及血管生成关系密切〔10〕。与野生型鼠相比，caveolin-1基因敲除鼠肿瘤血管通透性、肿瘤血管生成和肿瘤生长均增加〔9〕。这可能与在caveolin-1基因敲除鼠模型中，VEGF受体2磷酸化水平和内皮细胞一氧化氮(NO)合成酶(eNOS)活性升高有关〔10〕。在内皮细胞迁移过程中，caveolin-1也起着重要作用，当其表达水平下调后，内皮细胞移动受到抑制，可见caveolin-1可以促进内皮细胞迁移〔10，11〕。内皮细胞在生长未达到接触抑制前，caveolin-1可以抑制内皮细胞的增殖，且caveolin-1表达在血管生成刺激因子作用下降低；内皮细胞生长达到接触抑制状态时，caveolin-1表达不受血管生成刺激因子作用的影响〔9〕。其中VEGF最为关键〔11〕，EM患者腹腔液中VEGF 的含量显著高于正常妇女〔12〕。且EM严重程度与腹腔液中VEGF含量呈正相关〔13〕。

本研究表明EM大鼠子宫内膜组织中caveolin-1与VEGF可能通过其相互作用，参与子宫内膜血管新生的过程，这与文献报道〔14〕也较为一致。

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5徐丛剑，程明军，黄宇婷，等.子宫内膜异位症病因学研究进展〔J〕.中国实用妇科与产科杂志，2009；25(9)：712-4.

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10周德生，寇志刚，陈 瑶，等.Caveolin-1与血管新生相关性的研究进展〔J〕.中国临床新医学，2013；6(3)：270-2.

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13范 蕊，马 楠.子宫内膜异位症患者血清中VEGF和IGF-Ⅰ的表达及其相关性〔J〕.中国妇幼保健，2012；27(21)：3328-30.

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