黄体酮联合主动免疫治疗对复发流产相关因子的研究

曹井贺，杨爱军，位玲霞

(济宁医学院附属医院生殖医学科，山东 济宁 272000)

复发性流产是指临床上在1年内反复流产次数大于等于2次，且妊娠周数不超过20周，临床上复发性流产的发生率可达0.6%左右[1-2]。在复发性流产的患者中，仍然存在40%～50%的患者无明显的病因[3]。原因不明的复发性流产可以导致患者不全流产、人工流产次数的上升，特别是人工流产过程中的反复机械性损伤操作，可以增加患者远期并发症的发生。对于原因不明的复发性流产的治疗，可以改善患者妊娠结局，并降低多次人工流产导致的宫腔粘连等并发症的发生[4]。淋巴细胞主动免疫治疗在复发性流产的患者中具有一定的治疗效果，其可以通过改善母体与胚囊的免疫耐受、提高封闭抗体的浓度，进而维持妊娠状态[5-6]。本次研究重在探讨常规的黄体酮保胎治疗联合淋巴细胞免疫治疗的临床效果，进一步指导临床诊疗，研究报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2012年6月至2014年6月济宁医学院附属医院收治的174例原因不明复发性流产患者采用随机数字表分为试验组、对照组各87例。试验组87例患者，年龄24～38岁，平均年龄29.94±5.61岁，既往自然流产次数3～7次，平均4.9±0.8次。对照组87例患者，年龄23～38岁，平均年龄29.45±6.06岁，既往自然流产次数3～8次，平均5.1±0.9次。两组患者的上述资料比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。

1.2纳入标准

①入院检查患者排卵正常，月经周期、月经量均正常；②患者既往出现连续3次或3次以上的自然流产；③患者年龄20～39岁；④治疗前与患者签署知情同意书，同时报本院医学伦理委员会的批准。

1.3排除标准

①合并生殖系统疾病、器质性病变的患者；②合并自身免疫性疾病、内分泌疾病的患者；③染色体异常的患者；④对本研究治疗方法严重不耐受的患者。

1.4 治疗方法

对照组采用黄体酮针(国药准字：H20048596)，20mg，肌肉注射，每日1次，连续治疗至妊娠12周末；观察组在对照组的基础上联合使用淋巴细胞免疫治疗，采集静脉血30mL，进行常规的淋巴细胞分离，制备磷酸盐缓冲液，加入去离子水500mL混匀，加入碳酸氢钠调整pH值至7.4，并最终定容至1L，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)缓冲液洗涤3次，每次5min，调整淋巴细胞浓度为1×107/mL～5×107/mL，吸取0.5mL的淋巴细胞悬浮液于妊娠者前壁皮内5点注射，每次间隔3周，注射2次后鼓励患者妊娠，妊娠后再注射2次。

1.5疗效评价

以妊娠成功分娩活胎作为治疗成功的标准；检测并比较两组患者治疗前、治疗结束后的血清细胞因子：干扰素-γ(interferon-r，IFN-γ)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)以及调节蛋白(regulated on activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)因子的变化情况；对比两组患者治疗第1个疗程、第2个疗程的封闭抗体(blocking antibodies，BA)阳转率。

清晨采集空腹静脉血(第二次采血在治疗后的24～48h)，分离血清后，-20℃保存待测，采集标本后1周内检测RANTES、BA抗体，相关指标测定采用电化学发光全自动免疫分析仪(美国雅培i2000)，检测试剂盒购自福建新大陆生物技术有限公司。具体检测方法参照试剂盒说明书，试剂盒内配有质控血清或质控标准品，所有操作严格按照操作说明完成。

采集静脉血后1 000r/min(离心半径为15cm)，获得血清后抽取50μL样品加入96孔板内，采用去离子水作为阴性对照，采用50μL cryab作为阳性对照，平衡摇晃20s混匀，室温下孵育2h，采用TBSP缓冲液清洗3次，每次5min，加入100μL底物，平衡摇晃30～45s，25℃室温下孵育40min，加入250μL终止物，直到96孔板中每孔的颜色变黄，最后已空白对照为基准，采用分光光度计进行读数。IFN-γ、IL-8、IL-4抗体购自罗氏检测公司，相关配套试剂购自南京凯基生物科技有限公司，严格按照说明书的要求进行操作。

1.6统计学方法

2结果

2.1两组患者治疗前后血清细胞因子水平比较

治疗前，试验组和对照组患者血清IFN-γ、IL-8、IL-4、RANTES因子水平差异均无统计学意义(均P>0.05)；治疗后，两组患者的血清IFN-γ水平较治疗前显著降低(P<0.05)，IL-8、IL-4、RANTES因子较治疗前显著提高(均P<0.05)；治疗后，试验组患者的血清IFN-γ水平显著低于对照组(t=6.268，P<0.05)，IL-8、IL-4、RANTES因子显著高于对照组(t值分别为5.336，6.137，4.210，均P<0.05)，见表1。

项目试验组(n=87)对照组(n=87)tPIFN-γ(ng/L) 治疗前349.80±58.12 360.14±67.54 1.0790.282 治疗后264.96±47.21*#311.52±50.85*6.2680.000t7.2964.317P0.0000.000RANTES(ng/L) 治疗前228.75±114.06233.53±109.270.2840.777 治疗后429.63±127.58*#351.81±116.04*4.2100.000t9.1085.728P0.0000.000IL-4(pg/mL) 治疗前56.11±2.2355.80±1.820.9840.326 治疗后62.05±2.84*#59.34±3.06*6.1370.000t12.0478.556P0.0000.000IL-8(pg/mL) 治疗前316.33±98.57 330.12±101.850.9090.365 治疗后588.27±127.06*#489.54±116.81*5.3360.000t7.1654.085P0.0000.000

注：*为与治疗前比较，#为与对照组治疗后比较。

2.2两组患者治疗后BA阳转率比较

治疗1个疗程、2个疗程试验组的BA阳转率均显著高于对照组患者(均P<0.05)，见表2。

表2两组患者治疗后BA阳转率比较[n(%)]

Table 2 Comparison of BA positive conversion rate of patients between two groups after treatment [n(%)]

2.3两组患者治疗后妊娠情况

试验组的成功妊娠率、活胎分娩率均显著高于对照组(均P<0.05)，见表3。

表3两组患者治疗后妊娠情况[n(%)]

Table 3 Pregnancy results of patients between two groups after treatment [n(%)]

3讨论

3.1复发性流产的背景研究及发病机制分析

近年来原因不明复发性流产的发病率呈现出了明显上升的趋势，特别是在年龄25～35岁的人群中，其发病率更高。反复的流产不仅导致妊娠失败，同时可以促进宫腔粘连、功能性子宫出血、不孕及慢性盆腔炎症性疾病等的发生，临床预后不佳。对于其病因的探讨虽然迄今无明确的研究证实，但一般认为其发病可能与免疫耐受的异常有关[7]。不明原因复发性流产患者，其配偶的白细胞表面抗原或者染色体遗传抗原表位的相似度较高，精子中的父系遗传表位难以通过刺激母系的免疫系统产生相应的抗体，特别是封闭抗体的产物不足，导致受精卵在妊娠早期容易受到T淋巴细胞的杀伤作用而流产。另外，细胞炎症因子在介导CD4+、CD8+T淋巴细胞免疫的过程中发挥了重要的作用。IFN-γ可以通过提高树突状细胞、巨噬细胞等的抗原提呈效应，介导自然杀伤细胞的细胞毒性作用，促进胚囊滋养细胞的凋亡和新生血管的萎缩[5]；而IL可以发挥不同的效应，血清中IL-4、IL-8对于Th2细胞的激活作用可以参与到Th1/Th2淋巴细胞免疫的平衡过程中，抑制Th1/Th2平衡的左移导致的细胞免疫的激活，紊乱T淋巴细胞免疫，提高免疫耐受效果[6]。

3.2淋巴细胞主动免疫治疗复发性流产的机制

淋巴细胞主动免疫治疗是通过父系的外周血淋巴细胞的提取，注射入母体后诱导产生相应的封闭型抗体，并提高免疫耐受程度，减轻胚胎发育过程中的免疫紊乱、IFN-γ损伤等导致的流产的发生。已有的研究表明，淋巴细胞主动免疫治疗可以提高不明原因复发性流产患者的妊娠结局，提高活胎分娩比例[6]，但对于此过程中的RANTES、IFN-γ、IL-8、IL-4等的研究不足，此为本次研究的创新性所在。

3.3黄体酮联合主动免疫治疗对复发流产的临床效果

封闭抗体(BA)是胚囊发育的保护性抗体，可以起到屏障性的作用，本次研究中两组患者治疗后的BA抗体的阳性率均明显上升，其中观察组在治疗1个疗程及2个疗程后的BA阳性率均明显高于对照组，表明淋巴细胞免疫治疗可以提高BA的含量。注入母体中的淋巴细胞表面含有多种糖蛋白类分子，可以通过刺激浆细胞及B细胞分泌BA抗体，而循环血中上升的BA抗体可以抑制T淋巴细胞过度活化导致的胚囊的损伤。苗竹林等[8]研究者通过回顾性分析了74例不明原因复发性流产患者的临床资料，发现在主动免疫治疗的患者中，BA的平均阳性率可达70%以上，这与本次研究的结论较为一致，同时认为BA阳性率每上升20%，成功妊娠率可上升5%，临床预后明显改善。IFN-γ可以诱导CD4+T淋巴细胞激活，促进滋养细胞的凋亡，本研究中观察组治疗后的IFN-γ下降更为明显，IFN-γ对于胚囊的损伤作用减轻；IL-8、IL-4、RANTES可以稳定Th1/Th2T淋巴细胞系统的平衡，抑制免疫过度应答，特别是RANTES可以结合CD8+T淋巴细胞膜上的糖蛋白结合位点，减轻抗原刺激导致的排斥反应，本研究中治疗后的IL-8、IL-4、RANTES因子显著的高于对照组，差异具有统计学意义，相关细胞因子的上升可以改善母体免疫系统、提高母胎界面的封闭效率。对照组的受孕率较低，这主要考虑与入组患者的既往宫腔操作病史或者慢性盆腔炎症性疾病病史等有关，但也考虑与本次研究的样本量的总体代表性不足等有关。对于妊娠结局的分析可以发现，观察组的成功妊娠率及远期活胎分娩率均明显上升，妊娠结局的改善较为明显。

综上所述，淋巴细胞免疫治疗可以提高封闭抗体的阳性率，改善血清IFN-γ、IL-8、IL-4、RANTES等细胞因子水平，进而改善妊娠结局。后续研究可以增加样本量，进一步探讨淋巴细胞主动免疫治疗对于患者远期妊娠结局的分析。

[参考文献]

[1]Martínez-Ruiz A, Sarabia-Meseguer M D, Pérez-Fornieles J,etal. Placental growth factor, soluble fms-like tyrosine kinase 1 and progesterone as diagnostic biomarkers for ectopic pregnancy and missed abortion[J].Clin Biochem,2014,47(9):844-847.

[2]Coomarasamy A, Williams H, Truchanowicz E,etal. PROMISE: first-trimester progesterone therapy in women with a history of unexplained recurrent miscarriages-a randomised, double-blind, placebo-controlled, international multicentre trial and economic evaluation[J]. Health Technol Assess,2016,20(41):1-92.

[3]丛林,刘长明,朱立新,等.原因不明复发性流产患者淋巴细胞主动免疫治疗前后细胞亚群的变化[J].中国实用妇科与产科杂志,2012,28(5):378-380.

[4]孙莉,梁磊,杨波.主动联合被动免疫疗法治疗封闭抗体阴性孕妇复发性流产临床观察[J].山东医药,2015,55(43):44-45.

[5]Osmanagaoglu M A, Karahan S C, Aran T,etal. The diagnostic value of β-human chorionic gonadotropin, progesterone, and ischemia-modified albumin and their combined use in the prediction of first trimester abortions[J]. Int Sch Res Notices,2014,2014:846531.

[6]Liu Z, Xu H, Kang X,etal. Allogenic lymphocyte immunotherapy for unexplained recurrent spontaneous abortion: a meta-analysis[J]. Am J Reprod Immunol,2016,76(6):443-453.

[7]杨素娟,赵志明,王玮,等.主动免疫治疗原因不明复发性流产1005例疗效评价[J].实用妇产科杂志,2016,32(4):311-313.

[8]崔蓉, 钟兴明, 苗竹林,等. 精子DNA完整性对复发性流产的影响[J]. 海南医学, 2017, 28(12):2034-2036.