富氢盐水对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用机制

部 璇,王建军,白 静,程爱斌

(河北理工大学附属医院重症医学科，河北唐山 063000)

肾脏缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion,IR)是肾移植后较为严重的不可避免的并发症，对移植后的肾脏是否能够存活起到重要作用。引起肾脏IR的机制较为复杂，已有研究显示，活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成及炎症介质的释放在肾脏IR中发挥重要作用[1-2]。增多的氧自由基可以进一步引起细胞内的损伤，包括DNA损伤、蛋白质氧化和硝基化、脂质过氧化及细胞凋亡等[3]。氢气是一种惰性气体，具有明确的抗氧化和清除自由基的作用。研究显示，富氢溶液能够有效减轻经冷冻保存后进行移植肾脏的IR损伤。但是，相应的作用机制尚不完全明确。因此，本研究利用小鼠模型，探讨富氢盐水(hydrogen-rich water,HRS)对小鼠肾脏IR损伤中氧化及细胞凋亡相关蛋白的影响，阐明HRS减轻肾脏IR损伤机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性ICR小鼠80只，SPF级，体质量25～30 g，合格证号SCXK(京)2012-0001，购自北京华阜康实验动物有限公司。

1.2仪器与试剂 生理盐水购自华润双鹤药业股份有限公司；血生化检测试剂盒购自成都斯玛特科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)测定试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；二辛可宁酸(Bicinchoninic,BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；哺乳动物组织总蛋白提取试剂购自武汉博士德生物工程有限公司；Bcl2，Bcl-xl,Bax，Bak,Cleaved Caspase-3抗体购自美国Cell Signaling Technology(CST)公司；β-actin、抗兔辣根过氧化物酶抗体、抗鼠辣根过氧化物酶抗体购自美国Abcam公司。富氢水杯购自广州康旺电子科技有限公司；便携式兽用生化检测仪购自普朗医疗设备有限公司；可见光分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司；凝胶成像系统购自美国BioRad公司。

1.3方法

1.3.1HRS制备 向富氢水杯内加入200 mL生理盐水，按照厂家的操作步骤进行HRS的制备，每次使用时制备新的HRS。

1.3.2实验分组及模型制备 实验分为3组：对照(假手术)组，IR组，IR+HRS组，每组6只小鼠。IR+HRS组小鼠于手术前3 d及再灌注前1 min尾静脉注射0.2 mL HRS，再灌注后的2 h内每隔0.5 h注射1次HRS。对照组和IR组小鼠尾静脉注射相同体积的生理盐水。小鼠用3.5%水合氯醛溶液进行麻醉，腹部备皮仰卧于手术台上，对照组小鼠暴露肾脏并游离双侧肾蒂，但是不夹闭肾蒂。IR组和IR+HRS组用无损伤血管夹夹闭，45 min后松开恢复肾脏血流，肉眼观察肾脏颜色确认肾脏再灌注是否成功，逐层关闭小鼠腹腔。

1.3.3血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)检测 IR后24 h摘小鼠眼球取血，3 000 r/min离心10 min后取上清液即为小鼠血清。取100 μL血清加入血生化检测试剂盘内，生化分析仪检测SCr和BUN水平。

1.3.4肾组织SOD和MDA检测 IR后24 h获取小鼠肾脏，称取1 g肾组织剪碎后放到玻璃匀浆器内，按照组织质量(g)∶体积(mL)=1∶10的比例加入预冷的生理盐水，使用玻璃匀浆器匀浆，匀浆后的组织悬液以3 000 r/min离心10 min后取上清液，BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，按照试剂盒的操作步骤进行SOD及MDA检测。

1.3.5肾组织凋亡相关蛋白检测 IR后24 h获取小鼠肾脏，称取1 g肾组织剪碎后放到玻璃匀浆器内，加入预冷的含1%蛋白酶抑制剂的哺乳动物组织总蛋白提取液，研磨组织后冰上裂解1.5 h,以12 000 r/min离心10 min后取上清液即为蛋白提取物。BCA法检测蛋白浓度，加入上样缓冲液后沸水煮蛋白8 min使蛋白变性。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样量为20 μg，电压150 V,时间1.5 h。使用聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜转膜。转膜完成后使用5% BSA室温封闭1 h，将膜放入兔抗Bcl2(1∶1 000)抗体,兔抗Bcl-xl(1∶1 000) 抗体,兔抗Bax(1∶1 000) 抗体,兔抗Bak(1∶1 000) 抗体,兔抗Cleaved Caspase-3(1∶1 000) 抗体,鼠抗β-actin(1∶10 000)抗体液中进行孵育，孵育条件为4 ℃过夜。用TBST冲洗3次后，加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠和抗兔抗体，室温孵育1 h后，使用凝胶成像系统对蛋白条带进行分析。统计结果以目的蛋白的灰度值与β-actin蛋白的灰度值的比值代表相对蛋白表达水平。

2 结 果

2.1HRS处理降低小鼠血清SCr和BUN水平的影响 与对照组比较，IR后24 h小鼠血清SCr和BUN显著升高，HRS处理后IR小鼠血清SCr和BUN明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 HRS对小鼠血清SCr、BUN水平的影响

△:P<0.01，与对照组比较；*:P<0.01，与IR组比较

2.2HRS处理提高肾组织SOD酶活性同时降低MDA水平影响 与对照组比较，IR后24 h小鼠肾组织SOD酶活性显著下降，MDA水平明显增加，HRS预处理能够提高IR小鼠肾组织SOD活性并降低肾组织内的MDA水平，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 HRS对小鼠肾脏SOD及MDA水平的影响

△：P<0.01，与对照组比较；*：P<0.01，与IR组比较

2.3HRS处理改变凋亡相关蛋白的表达 与对照组比较，I/R组抗凋亡蛋白Bcl2和Bcl-xl在IR后24 h表达下调，促凋亡蛋白Bax,Bak,Cleaved Caspase-3表达上调，HRS预处理能够上调IR后小鼠肾组织抗凋亡蛋白表达，下调促凋亡蛋白表达，结果差异具有统计学意义(P<0.05),见图1。

##:P<0.01，与对照组比较；*:P<0.05，**:P<0.01，与IR组比较

图1 HRS对凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨 论

2007年日本OHSAWA等[4]报道氢气能够通过选择性清除羟自由基降低脑组织的IR，直接证实氢气作为抗氧化剂具有治疗作用[4]。随后，关于氢气治疗组织IR的研究越来越多，研究显示，吸入氢气或饮用富氢水能够减轻大鼠或小鼠大脑、肝脏、肾脏、卵巢、肌肉、小肠等组织器官的IR[3,4-9]。据报道，将待移植的大鼠肾脏放入预冷的富氢溶液中保存24～48 h后，移植肾脏的功能和移植受体存活率得到极大的提高，其作用机制主要是减少肾小管上皮细胞的炎性反应和凋亡[1,8]，但是相关的信号通路变化并没有得到深入研究。曾葵等[9]研究显示，对大鼠IR模型在再灌注前10 min和再灌注后120 min持续进行吸入氢气处理，能够有效减轻大鼠肾脏损伤，但是作用机制也没有深入研究[9]。因此，本研究以小鼠肾脏IR模型为研究对象，观察静脉注射HRS对小鼠IR后肾脏功能、肾脏SOD、MDA水平以及凋亡相关的信号通路影响，阐明HRS减轻肾脏IR损伤的作用机制。

CUI等[5]研究显示，静脉注射HRS 1 min后，肾脏氢气浓度达到峰值，因此本研究选择在肾脏IR前1 min静脉注射HRS，IR后的2 h内每0.5小时注射1次HRS。结果显示，HRS预处理能够有效降低血清SCr和BUN水平，减轻肾功能损伤，这项结果与之前研究一致[9]。MDA是脂质过氧化反应中的中间产物，反映组织受氧自由基损伤的程度；SOD是体内超氧自由基的清除因子，SOD水平的高低决定组织清除自由基的能力[10]。本结果显示，HRS处理能够有效减轻MDA的产生，提高SOD酶活性，进而提高IR后肾组织抗氧化能力。

在细胞凋亡的过程中，Bcl2家族成员发挥着重要的作用。Bcl2家族可以分为两大类，一类为抗凋亡蛋白包括Bcl2,Bcl-xl等蛋白，一类为促凋亡蛋白包括Bak，Bax等蛋白。而Caspase-3是凋亡级联反应中最关键的凋亡蛋白酶，当收到上游凋亡信号后，Caspase-3被活化变成Cleaved Caspase-3,启动凋亡的发生过程[11-12]。本研究结果显示，肾脏IR后24 h Bcl2,Bcl-xl蛋白表达水平下调，Bak，Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达上调。HRS处理后能明显上调Bcl2,Bcl-xl蛋白表达，下调Bak，Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达。

综上所述，本研究结果显示，静脉注射HRS能够减轻小鼠肾脏IR损伤，其作用机制可能是通过降低组织内的ROS水平，增加组织抗氧化能力，并且通过调节Bcl2家族成员蛋白及Caspase-3蛋白降低肾脏组织细胞凋亡。氢气作为一种无毒无害的具有抗氧化能力的气体，在临床上有巨大的应用前景。关于氢气对肾脏IR后炎症细胞因子的影响在本研究中并没有阐明，这项研究值得在以后的工作中深入开展。

[1]ESPOSITO E,MONDELLO S,DI PAOLA R A,et al.Glutamine contributes to ameliorate inflammation after renal ischemia/reperfusion injury in rats[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2011,383(5):493-508.

[2]LIU D,SHANG H,LIU Y.Stanniocalcin-1 protects a mouse model from renal ischemia-reperfusion injury by affecting ROS-mediated multiple signaling pathways[J].2016,17(7):1051-1060.

[3]HAN L,TIAN R,YAN H,et al.Hydrogen-rich water protects against ischemic brain injury in rats by regulating calcium buffering proteins[J].Brain Res,2015,1615(7):129-138.

[4]OHSAWA I,ISHIKAWA M,TAKAHASHI K,et al.Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J].Nat Med,2007,13(6):688-694.

[5]CUI J,CHEN X,ZHAI X,et al.Inhalation of water electrolysis-derived hydrogen ameliorates cerebral ischemia-reperfusion injury in rats - a possible new hydrogen resource for clinical use[J].Neuroscience,2016,335(5):232-241.

[6]HUANG T L,WANG W C,TU C,et al.Hydrogen-rich saline attenuates ischemia-reperfusion injury in skeletal muscle[J].J Surg Res,2015,194(2):471-480.

[7]SHIGETA T,SAKAMOTO S,LI X K,et al.Luminal injection of hydrogen-rich solution attenuates intestinal ischemia-reperfusion injury in rats[J].Transplantation,2015 99(3):500-507.

[8]ABE T,LI X K,YAZAWA K,et al.Hydrogen-rich University of Wisconsin solution attenuates renal cold ischemia-reperfusion injury[J].Transplantation,2012,94(1):14-21.

[9]曾葵，黄瀚，江晓琴，等．氢气对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用[J]．四川大学学报(医学版)，2014，45(1)：39-42．

[10]GHASEMI M,NEMATBAKHSH M,DANESHMAND F,et al.Role of nitric oxide in kidney and liver(as distance organ)function in bilateral renal ischemia-reperfusion:effect of L-Arginine and NG-nitro-L-Arginine methyl ester[J].Adv Biomed Res,2015,5(4):233.

[11]LIU X J,HE Y J,LI F,et al.Caspase-3 promotes genetic instability and carcinogenesis[J].Mol Cell,2015,58(2):284-296.

[12]DAI Y,JIN S G,LI X E,et al.The involvement of Bcl-2 family proteins in AKT-regulated cell survival in cisplatin resistant epithelial ovarian cancer[J].Oncotarget,2017,8(1):1354-1368.