MTHFR及TPMT基因多态性对儿童急性淋巴细胞白血病化疗不良反应的影响

齐兴菊，冯 杰

(贵州省人民医院儿科，贵阳 550002)

急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童期常见的恶性肿瘤，发病数占儿童恶性肿瘤的25%～35%[1]。绝大多数ALL患儿单纯依靠化疗就能获得长期的无病生存状态[2-3]。甲氨蝶呤(MTX)、6-巯基嘌呤(6-MP)是治疗儿童ALL的重要化疗药物，但其不良反应会影响患儿化疗的顺利进行。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢中的限速酶，巯嘌呤甲基转移酶(TPMT)是6-MP代谢分解的重要酶之一。二者单核苷酸基因多态性(SDP)对于MTX及6-MP化疗的不良反应有一定相关性[4-5]。对MTHFR及TPMT单核苷酸基因多态性(SDP)的研究，可以为ALL患儿个体化治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2014年1月至2016年10月在本院儿内血液科确诊并住院治疗的汉族ALL患儿98例为研究对象。其中，男64例，女34例，年龄(5.36±2.14)岁。所有ALL患儿的诊断均符合全国儿童ALL诊疗建议[6]。根据临床危险度对患儿分组[7]:高危组16例，男11例，女5例，年龄(6.03±2.26)岁；中危组39例，男27例，女12例，年龄(5.94±2.64)岁；标危组43例，男26例，女17例，年龄(5.76±2.38)岁。患儿经前期强化及巩固治疗都已达完全缓解后进入维持治疗。本研究获医院伦理评审委员会批准，所有患儿家长均知情同意。

1.2方法

1.2.1治疗方案 根据儿童CCLG-ALL2008方案，全部患儿均行大剂量(HD)-MTX+醛氢叶酸(CF)+6-MP方案化疗，MTX行24 h静脉滴注，先以10%突击剂量在0.5 h内快速静滴，其余90%在23.5 h内均匀滴入。中危与高危组MTX剂量为5 g/m2，标危组为3 g/m2。突击量MTX滴后2 h内，中危与高危组以MTX、地塞米松及阿糖胞苷等三联药物进行1次鞘内注射，标危组以MTX进行1次鞘内注射。MTX开始42 h后以剂量为15 mg/m2的CF解救，给药间隔为6 h，给药频次为6～8次。HD-MTX前5 d以大剂量水化碱化(液体总量如下：中高危3 000～4 000 mL·m-2·d-1，标危2 000～3 000 mL·m-2·d-1，总碱量130 mL·m-2·d-1)。与此同时，每天临睡前顿服6-MP 25 mg/m2。治疗期间监测24 h水量出入，并使尿pH值维持在7.0～8.0。化疗时常规保护重要脏器、胃肠道与口腔黏膜。

1.2.2基因分型检测

1.2.2.1主要试剂与仪器 QIAamp RNA Blood Mini Kit试剂盒购自天根生化科技有限公司，Reverse Transcriptase XL逆转录试剂盒购自大连Takara公司，琼脂糖购自西班牙Pharmerisco公司，所有引物均由华大基因科技公司合成。主要仪器为梯度PCR检测仪(德国Biometra公司)、核酸电泳系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2.2.2RNA提取及cDNA制备 抽取患儿外周血2 mL，EDTA抗凝并于-70 ℃保存。使用QIAamp RNA试剂盒提取总RNA，并采用Reverse Transcriptase XL逆转录试剂盒制备cDNA，均按试剂盒说明书操作。

1.2.2.3引物设计 自Genbank获取MTHFR及TPMT的核苷酸序列，MTHFR C677T、MTHFR A1298C的引物设计依据伍艳鹏等[8]文献，TPMT A719G、TPMT G460A 的引物设计分别参照ASHAVAID等[9]与ZHANG等[10]的文献。

1.2.2.4PCR扩增 MTHFR C677T与MTHFR A1298C的总反应体系为50.00 μL：去离子水17.00 μL,正向与反向引物(10 μmol/L)各2.00 μL,Mix(2×)25.00 μL,DNA模板4.00 μL。反应条件均为：95 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行36个循环；之后72 ℃ 延伸5 min。TPMT A719G、TPMT G460A的总反应体系为50.00 μL：去离子水35.75 μL、正向与反向引物(10 μmol /L)各1.00 μL,dNTP Mix 4.00 μL,Taq 0.25 μL,缓冲液8.00 μL。反应条件均为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；之后72 ℃ 延伸4 min。

1.2.2.5PCR产物电泳及测序 取待测PCR产物5.0 μL及Marker 7.5 μL，加入3%琼脂糖凝胶孔内，电泳60 min，电压为60 mV，凝胶成像系统拍照。有异常条带的样本原液送华大基因科技公司纯化后直接测序。

1.2.3不良反应评价 参照美国国立癌症研究所常规毒性判定标准(NCI-CTC)[11]记录研究对象化疗过程中发生的不良反应，观察指标为:黏膜损伤表现为口腔炎；胃肠道反应以腹泻、呕吐为主；肝脏毒性主要表现为丙氨酸氨基转移酶及天门冬氨酸基转移酶升高；骨髓抑制主要以血小板及血红蛋白下降，外周血中性粒细胞降低。分级大于Ⅱ级为化疗不良反应。

2 结 果

2.1MTHFR基因型分布 98例ALL患儿MTHFR C677T位点：CC野生型33例(33.67%),CT杂合型46例(46.94%),TT纯合型19例(19.39%)。A1298C位点：AA野生型54例(55.10%),AC杂合型32例(32.65%),CC纯合型12例(12.24%)。C677T及A1298C各位点基因型在不同临床分组中比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。ALL患儿MTHFR C677T和A1298C的突变率分别为66.33%和44.90%。

表1 ALL患儿各基因型分布[n(%)]

2.2TPMT基因型分布 98例ALL患儿TPMT A719G位点：AA野生型86例(87.76%),AG杂合型7例(7.14%)，GG纯合型5例(5.10%)。TPMT G460A位点：GG野生型89例(90.82%)，GA杂合型5例(5.10%)，AA纯合型4例(4.08%)。A719G及G460A各位点基因型在不同临床分组中比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 ALL患儿TPMT A719G、G460A基因型分布[n(%)]

2.3MTHFR基因型与化疗不良反应的关系 98例ALL患儿中，出现血小板减少、血红蛋白降低和中性粒细胞减少的分别有14例(14.29%)，51例(52.04%)和78例(79.59%)，发生黏膜损伤25例(25.51%)，肝脏毒性21例(21.43%)及胃肠道反应36例(36.73%)。C677T各SNP相关化疗后不良反应比较差异均无统计学意义(P>0.05);A1298AC出现血小板减少的比例(28.13%)高于A1298AA基因型(7.41%)与A1298CC基因型(8.33%)，A1298AA发生黏膜损伤的比例(9.26%)低于A1298AC基因型(43.75%)与A1298CC基因型(50.00%)，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，其余不良反应与A1298C各SNP比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.4TPMT基因型与化疗不良反应的关系 A719G各SNP相关化疗后不良反应比较差异均无统计学意义(P>0.05)，G460A各SNP各相关不良反应比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表3 MTHFR C677T、A1298C基因多态性与化疗后不良反应的关系(n)

表4 TPMT A719G、G460A基因多态性与化疗后不良反应的关系(n)

3 讨 论

随着众多基因的SNP位点的发现，ALL患儿的用药个体化与基因多态性的关系正日益得到关注，影响ALL患儿化疗药物代谢的基因多态性已被作为ALL化疗不良反应与预后的预测因素。抗叶酸剂MTX是治疗ALL的重要药物，MTX经膜叶酸受体及还原叶酸载体进入细胞内，再经合成酶催化多聚谷氨酸化形成MTXPGs，从而发挥竞争性抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)的作用，使DNA复制所必需的dTMP合成受抑制而发挥抗肿瘤作用。MTHFR是叶酸代谢相关酶，能催化亚甲基四氢叶酸转变为甲基四氢叶酸，其催化的代谢途径能被MTX抑制，因而MTX的不良反应及药理作用与MTHFR的多态性关系密切[12]。6-MP是治疗儿童ALL的抗嘌呤代谢药物，通过抑制嘌呤合成途径，竞争性抑制次黄嘌呤的转变，并阻碍DNA合成，使淋巴细胞增殖受到抑制，是维持治疗的重要药物，但6-MP必须经过代谢生成硫鸟嘌呤核苷酸(TGNs)后才能发挥抗肿瘤活性。TPMT能将6-MP催化转变为无活性的甲基化代谢物，从而降低稳态TGNs水平。研究显示对6-MP敏感性低的ALL患儿在使用标准剂量药物后因抑制作用不充分而易复发，而敏感性高的患儿则易出现不良反应，导致药物效应差异的主要原因是药物代谢酶基因的差异[5]。TPMT是6-MP代谢过程的关键酶，其基因多态性与ALL患儿的个性化剂量及不良反应也受到高度关注。

研究显示，不同地区和种族的人群MTHFR、TPMT各SNP的突变情况及频率有所不同。本研究结果表明，本地区ALL患儿MTHFR C677T和A1298C的突变率分别达66.33%和44.90%，与郑苗苗等[13]、伍艳鹏等[8]研究相似。本研究TPMT A719G、G460A的突变率分别为12.24%及9.18%，高于谢茜等[5]及陈小文等[14]研究，提示中国不同地区人群可能具有特征性的基因变异。由于MTHFR在MTX与叶酸的代谢中起重要的作用，MTHFR C677T和A1298C 2个基因位点的变异可改变酶的活性，从而影响MTX的化疗效应[15]。目前对于MTHFR C677T和A1298C与MTX化疗不良反应的关系具有不同的观点，LIU等[16]研究显示677CT/TT基因型会使ALL患儿出现血小板降低的风险增加，而677TT基因型相对于677CC野生型，导致黏膜损害及肝脏毒性的风险也出现升高[17]。本研究显示C677T各基因型出现MTX化疗不良反应的差异无统计学意义，与郑苗苗等[13]、廖清船等[18]研究一致。本研究发现A1298AC出现血小板减少的风险增加(P<0.05)，KANTAR等[19]研究显示1298AC/CC基因型使肝毒性及骨髓抑制的风险上升。推测MTHFR A1298C多态性代谢过程中亚甲基四氢叶酸分流至DNA合成补救途径较低，使DNA合成受到抑制，并在细胞内与MTX共同抑制二氢叶酸转化为四氢叶酸，阻断胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸合成，从而导致较为严重的不良反应。但也有研究报道A1298C SNP与MTX不良反应无显著相关[20]。本研究显示A1298AA出现黏膜损伤的风险下降(P<0.05)，与伍艳鹏等[8]研究一致。MTHFR A1298AA基因突变时可能将谷氨酸错译为丙氨酸，并增加产生胸腺核苷酸酶作用物，可合成更多的DNA从而降低不良作用。本研究显示，TPMT A719G、G460A各SNP与化疗后不良反应的出现均无明显关联，与谢茜等[5]研究结果一致。提示不同地区的TPMT的基因多态性可能存在差异。此外，只对2个TPMT的位点多态性进行检测可能无法评价其与6-MP的不良反应的关系。

综上所述，MTHFR A1298C的基因多态性可能影响ALL患儿化疗出现的不良反应，临床治疗时可依据对MTHFR A1298C SNP的检测预测患儿MTX化疗后不良反应。同时，可考虑对TPMT其他基因多态性进一步检测，明确TPMT与6-MP化疗不良反应的关系，以指导ALL患儿的个体化治疗。考虑到基因多态性对ALL化疗可能具有的综合影响，还需进一步扩大样本量，进行更加深入地研究。

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