紫花苜蓿高效共生固氮根瘤菌的筛选

杨淑君，何永攀，张学洲，兰吉勇，张荟荟，柯梅

（1.新疆畜牧科学院草业研究所，乌鲁木齐 830000；2.新疆生产建设兵团第十二师三坪农场，乌鲁木齐 830000）

根瘤菌是作为广泛地分布在土壤当中的一类革兰氏的阴性细菌[1-2]。根瘤菌能够侵染豆科植物的根部，并在其根部形成根瘤[3]。对空气当中分子态的氮进行固定以形成氨类，从而为豆科植物提供起氮素的营养支持。根瘤菌和豆科植物的和谐共生是自然界当中生物固氮的一个最强体系[4]。其所固定氮占生物的固氮总量超过65%。当前全世界的各种类的蛋白食物当中，约有超过20%是源于豆科植物[5]。在我国已知的豆科植物种类大概接近1400种。其中从草本豆科到乔木豆科，豆科植物的生态、形态以及其生活习性都具有多样化。其中的大部分也都可以为根瘤菌所感染并且在根部结瘤。根瘤菌的固氮不仅可以提高对豆科植物的产量，改善植物的品质，同时也可以节约氮肥并且降低生产的成本，同时提高土壤的肥力，改善土壤的结构等效果。根瘤菌的作用为该土地的后茬作物充分的提供了纯天然的氮素营养。但是根瘤菌也并不意味对于所有的寄主豆科植物都能实现提高其宿主的产量或者品质。根瘤菌的结瘤过程是一个竞争的过程，有众多的因素都影响着根瘤菌的结瘤以及其与宿主植物的共生同氮的效率。众多因素也包括了土壤的条件、土壤中的土著种根瘤菌、宿主植物的品种、植物和根瘤菌相互的作用等等。因此，对于豆科宿主植物与其根瘤菌的共生固氮优良组合的筛选，在一直以来也是生物固氮这一研究领域的一个重要热点。

紫花苜蓿不仅能为我国的草地、畜牧业发展供给重要、优质的蛋白类饲料，且由于有固氮菌的固氮作用，其也能起到土壤培肥，对生态环境进行改善作用，从而对提高中低产田利用率起到明显的作用。本文通过研究紫花苜蓿接种的8株根瘤菌，在温室的条件之下生长情况以及其结瘤的具体状况，筛选出具备最佳的共生匹配关系的固氮根瘤菌的菌株。以实现增产的效果，且为紫花苜蓿的高效固氮根瘤菌筛选的理论依据提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物

紫花苜蓿，由本所昌吉综合试验站种植并供种。

1.1.2 供试菌株

固氮菌株由我所前期项目筛选保存根瘤菌。

表1 8株供试菌株表

1.1.3 土壤

X牧区试验地的表土（该厂种过相关的豆科牧草，且前茬为禾本科的草本植物），本研究选用的土壤为普通壤土，同时土质相对均匀一致，土壤中pH 8.2，全氮含量 0.062%。

1.1.4 培养基

应用实验室自制固体培养基（l l蒸馏水、琼脂粉 15 g、甘露醇 10 g、K2HPO4为 0.25 g、KH2PO4为 0.25 g、MgSO4为0.2 g、NaCl为0.1 g、CaC03为3 g），pH控制 6.8～7.2 之间。

1.2 方法

1.2.1 活化根瘤茵

8株供试菌株分别接种于克氏瓶中培养基上，28℃温度下培养2 d至其对数生长期，之后那个100 ml的无菌水对菌体洗下并装入到无菌的三角瓶当中。通过旋涡振荡法打散菌体之后取其中的一部分测定OD值，之后使每毫升的菌悬液当中根瘤菌个数达到20亿。

其中的计算公式为：根瘤菌数=各方格中根瘤菌数的平均值/16*4000*1000*稀释倍数。

1.2.2 种子的处理与根瘤菌的接种

紫花苜蓿种子经过浓度 95%的乙醇进行处理10 min后。在无菌水下5～6次冲洗后再用浓度0.1%HgCl表面消毒，再在无菌水下5～6次并置于培养皿当中，于28℃的培养箱进行2 d培养催芽。后于培养基中加入备用菌悬液，再加发芽一致，根的长约为1 cm紫花苜蓿种子，进行浸泡达15 min后用镊子进行夹取，并植入装一定土壤塑料花盆种植。该方法分别对8种各不同的根瘤菌接种进行处理，每中各做3个重复实验，并以不进行接种植株作为对照，同样3个重复实验。统一培养。

1.3 测定接种效果

在接种的45 d之后进行收获。将紫花苜蓿的地上部（第一片子叶的叶痕处上端）剪下后，分别进行装袋，处理称干重；收获时再把紫花苜蓿根系用水进行洗净，测每盆植株的总根瘤数量。

1.4 数据处理方法

用SPSS19.0统计学软件结合EXCEl表格进行数据处理分析。

2 结果分析

2.1 紫花苜蓿接种后生长的效应

紫花苜蓿接种8株不同的根瘤菌之后，其干草重与对照间差异显著(P＜0.05)，其中（ACCC04、ACCC03和ACCC05）的菌株干草重显著的高于其他的处理。其中增幅最大的是ACCC04，干草重达3.72 g，高于对照26.33%。增幅最小为ACCC08。高于对照3.82%，在接种了根瘤菌后，对紫花苜蓿的生长影响不明显，只有ACCC05存在显著差异，其他的菌株间均无明显的差异，但8个处理的干根重均显著大于对照，说明根瘤菌的接种对于紫花苜蓿生长具一定的促进作用。

2.2 紫花苜蓿接种后固氮效应

接种了根瘤菌之后，能显著的提高了紫花苜蓿结瘤的能力。接种了根瘤菌后紫花苜蓿结瘤的能力也存在差异，其中31菌株根瘤数最多，其次是ACCC08和ACCC05根瘤数，比对照增加41.33%、29.43%与25.43%。而根瘤数增加最少的菌株是ACCC04，对比对照仅为3%。

上述的定指标：接种ACCC 44根瘤菌后紫花苜蓿的效果最佳。可有效的增加紫花苜蓿的产草量。是紫花苜蓿最佳的一个匹配菌株。

3 讨论

本研究选取8株根瘤菌对紫花苜蓿接种，8株根瘤菌的接种效果存在明显的差异；在接种之后的干草重、根瘤数与对照相比分别各增加3.82%～26.33%、3.00%～41.33%；筛选出与紫花苜蓿最佳的共生匹配的固氮根瘤菌ACCC05，该固氮根瘤菌菌株能够显著的增强其固氮效果，在提高草产量选择该固氮菌具一定生产与应用的价值。

[1] 韩志顺，郑敏娜，梁秀芝．接种不同根瘤菌对紫花苜蓿固氮效能及生物量的影响[J]．华北农学报，2016，31(4):214-219．

[2] 朱秋莲，邢肖毅，程曼，等．宁南山区典型植物根际与非根际土壤碳、氮形态[J]．应用生态学报，2013，24(4):983-988．

[3] 孙向辉，腾应，骆永明．接种根瘤菌对紫花苜蓿吸收转运PCB28及抗PCB28污染能力的影响[J]．河南农业科学，2014，43(3):65-69.

[4] 王军．不同施肥水平下接种AMF和根瘤菌对紫花苜蓿生长及养分吸收的影响[D]．北京：北京林业大学，2012．

[5] 杨何宝，李继泉，王俊娟，等．施肥和苜蓿接种根瘤菌对苜蓿生长及铁尾矿砂基质理化性质的影响[J]．草业学报，2016，25(2):68-76．