新疆阿拉尔市绵羊产单核细胞李氏杆菌带菌情况的调查

吴 静,陈 瑛,贾桂珍

(塔里木大学动物科学学院,新疆 阿拉尔 843300)

产单核细胞李氏杆菌(Listeria mohocytogehes,L.mohocytogehes)是一种重要的人兽共患病病原菌,自1926年Murray等[1]从家兔体内首次分离到本病原以来,它已呈世界性分布,在包括人类在内的40多种哺乳动物、20多种飞禽类和部分水生动物均可分离到该菌。国内有关动物李氏杆菌病例的报道很多,波及全国10个省市,涉及动物有绵羊、山羊、牛、猪、鸡、兔、鸭、鹅、鹿、鹦鹉、北极狐等,平均死亡率达32%以上,对畜牧业造成了较大的危害。在动物中绵羊对产单核细胞李氏杆菌的易感性最高,其感染多与青贮饲料相关[2]。目前,WHO已将产单核细胞李氏杆菌定为20世纪90年代四大食源性疾病致病菌[3]。中国预防医学科学院流行病学微生物研究所徐建国博士也将其列为21世纪对中国人卫生健康具有重大影响的12种病原微生物之一[4],对人类健康造成极大威胁。

本试验以阿拉尔周边绵羊为研究对象,无菌采集绵羊的鼻液,通过传统细菌分离鉴定技术,进行产单核细胞李氏杆菌的分离鉴定,收集产单核细胞李氏杆菌的资源;并对鉴定菌株通过小鼠实验测得单核细胞李氏杆菌的致病性。调查结果为该地区动物性食品安全评估及李氏杆菌的监测提供参考和科学数据。对于李氏杆菌病的预防、诊断和治疗新疆地区李氏杆菌病提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验对象 阿拉尔周边绵羊。

1.1.2 试剂和培养基 0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)、PALCAM 琼脂、LB肉汤,均购自杭州天和微生物试剂有限公司;血琼脂平板、糖发酵试验培养基;木糖、七叶苷由塔里木大学动物科学学院微生物生物实验室提供;1%盐酸吖啶黄、1%萘啶酮酸钠盐、PALCAM选择性添加剂,购自杭州天和微生物试剂有限公司;甲基红、V-P试验培养基自制;甲基红指示剂、V-P试验指示剂、革兰染液由塔里木大学动物科学学院微生物生物实验室提供。

1.1.3 试验动物 体重18～20 g小鼠10只由塔里木大学动物科学学院实验站提供。

1.1.4 主要仪器 立式电热压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂,型号:LDZX-50KB);数显不锈钢电热培养箱(上海博迅实业有限公司生产,型号:HPX-9272MBE);洁净工作台(上海博迅实业有限公司生产,型号:SW-CJ-ZF);电子显微镜(莱卡制造)、电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司,型号:DK-S26);冰箱、电子天平、摇床、三角瓶、无菌平皿、试管、1 mL无菌注射器等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集及预处理 以无菌操作用灭菌棉签在绵羊鼻腔中刮取分泌物,共采集样品120份,其中9团采集60份,10团采集60份。

1.2.2 增菌 参照国标GB/T4789.30-2010法将采集的120份样品,分别放入5 mL LB 1增菌液中,恒温培养箱培养(30℃ ±1℃,24 h),然后用移液枪移取0.1 mL,转种于10 mL LB 2增菌液内,放入摇床30℃ ±1℃培养18 h～24 h。

1.2.3 划线分离培养 采用三区划线法将LB 2增菌液划线接种于PALCAM琼脂平板,放入恒温培养箱36℃ ±1℃培养24 h～48 h,观察各个平板上生长的菌落。

1.2.4 革兰染色 挑取典型菌落涂片,革兰染色镜检。根据菌体形态及染色特性初步判定,并将其进一步纯化培养。通过镜检挑取形态特征和排列与产单核细胞李氏杆菌相似的菌落划线接种与0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)斜面,于恒温培养箱30℃ ±1℃培养24 h～48 h,即为纯培养。

1.2.5 生化鉴定 将纯培养物分别接种于M.R.、V-P、木糖、鼠李糖、甘露醇、七叶苷、葡萄糖、麦芽糖等培养基中,于36℃ ±1℃培养18～24 h。

1.2.6 小鼠毒力试验 从已鉴定为产单核细胞李氏杆菌分离菌株试管斜面上挑取1接种环的细菌接种于含5 mL LB的试管中,置37℃培养箱中培养24 h后,取0.1 mL接种0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)斜面上培养8 h～12 h后,用L棒刮下菌苔,用5 mL灭菌的生理盐水稀释与标准麦氏比浊管比浊。并根据比浊管所含的细菌浓度换算出所需的菌悬液浓度,即每毫升含1.0×1010CFU/mL的菌悬液,所得出的就是测试菌液。取此菌悬液进行小鼠腹腔注射,每株菌注射2只,每只注射0.5 mL,观察小鼠发病及死亡情况,并设置对照组,对照组小鼠注射0.5 mL灭菌生理盐水。

2 试验结果

2.1 分离培养结果 在120份样品中有11份样品在PALCAM琼脂培养基长出了疑似产单核细胞李氏杆菌的特征性菌落,菌落为圆形灰绿色,大小2～3 mm,有些菌落有黑色凹陷。

2.2 革兰氏染色结果 对11份样品中的典型菌落进行革兰染色,染色镜检显示,有9份样品中染色结果符合产单核细胞李氏杆菌,产单核细胞李氏杆菌为革兰阳性短小杆菌,大小为 0.4～0.5 μm ×0.5～2 μm,两端钝圆,呈“V”字形或“ Y”字形,单在排列。通过分离培养和染色镜检,得到9株疑似产单核细胞李氏杆菌的纯培养物。

2.3 生化鉴定结果 9株菌的生化鉴定结果见表1。

表1 产单核细胞李氏杆菌的生化鉴定

通过生化鉴定,9株菌中有4株菌符合产单核细胞李氏杆菌,分别是1,2,5号和8号菌株;产单核细胞李氏杆菌M.R.、V-P试验阳性,能发酵麦芽糖、葡萄糖、鼠李糖和七叶苷,不发酵甘露醇和木糖。

2.4 小鼠毒力试验结果 小鼠接种1号、2号、5号、8号产单核细胞李氏杆菌6～8 h后表现食欲不振,精神委靡,被毛杂乱,运动迟缓,呼吸困难。其中1号、2号表现为身体向一侧倾斜,后腿拖拉,共济失调,最后死亡。剖检死亡的小鼠可见胸腔积液,肺脏肿大、边缘钝圆,有出血斑,肝脏肿大,呈紫红色。

3 讨论

产单核细胞李氏杆菌病是由产单核细胞李氏杆菌引起的一种人兽共患病,其中羊最为敏感。产单核细胞李氏杆菌作为一种重要的病原菌,广泛存在于自然界,由于产单核细胞李氏杆菌对各种恶劣环境条件有着较强的耐受性,使得其较易处于食物链的每一个环节而导致人和动物发病,使得各种食品受到污染,最终严重威胁人类的健康[5]。本试验通过传统的细菌分离鉴定技术从阿拉尔市周边规模化养羊场采集的样本中分离出4株产单核细胞李氏杆菌,且4株产单核细胞李氏杆菌对小鼠均有致病性,可见产单核细胞李氏杆菌为阿拉尔市规模化养羊场的主要病原菌之一。通过阿拉尔市周边规模化养羊场产单核细胞李氏杆菌带菌情况的调查,为阿拉尔市规模化养羊场羊病防治提供理论依据。

从新疆阿拉尔周边样品的产单核细胞李氏杆菌调查结果来看,120份样品中有4份样品为阳性,阳性率为3.3%,与王一明等调查的结果基本相似,阳性率为4.0%[6]。此调查采集都是新鲜样品,在生产线上第一时间采集,样品受环境污染机率较小,可以真实反映羊群的带菌情况,但是还需对分离鉴定菌株进行分子水平的毒力基因检测等。

产单核细胞李氏杆菌作为一种重要的食源性人兽共患性病原在过去的几十年一直受到高度重视,相信随着对单核细胞李氏杆菌的深人研究,我们会更加深人和全面地了解病原菌的致病机制,为更好地控制重大疾病提供依据。

4 结论

从阿拉尔市无菌操作采集羊鼻拭检样120份,其中4份样品中分离并鉴定为产单核细胞李氏杆菌,带菌率达3.3%。

对鉴定的4株进行小鼠的致病性试验,分离鉴定的4株产单核细胞李氏杆菌均引起小鼠发病,其中2株菌可使小鼠在感染后72 h内死亡。调查结果为该地区动物性食品安全评估及产单核细胞李氏杆菌的监测提供参考和科学依据。

参考文献:

[1] Murray E G D,Webb R A,Swann M B R.A disease of rabbits characterized by a large mononuclear leucocytosos,caused by a hitherto undescribed bacillus bacterium monocytogenes[J].J Pathol bacterial,1926,29:407-439.

[2] 杨霞,剡根强,王静梅,等.新疆部分地区绵羊及青贮饲草中单核细胞增多性李氏杆菌的调查[J].中国兽医杂志,2004,40(8):19-20.

[3] Membre J M,Kubaczka M,Dubois J,et al.Temperature effect on Listeria monocytogenes Growth in the event of Contamination of Cooked Pork Products[J].Food Prot,2004,67(3):463-469.

[4] 十二种病原微生物可能影响中国人的健康.www.biologic.cn2088.com,2002,04:05.

[5] 马光强,刘丽娟,文明,等.山羊源产单核细胞李斯特菌的分离与鉴定[J].动物医学进展,2016,37(3):33-38.

[6] 王一明,张海兰,李静,等.新疆部分地区绵羊及其环境中单核细胞增多性李氏杆菌分布状况的调查[J].家畜生态学报,2008,29(3):90-92.