不同生理阶段小鼠雌激素受体水平及IL-13、TNF-α含量的变化

唐飞，徐娟，邵明君

(浙江金华市中心医院妇科，金华 321000)

众所周知，人类内分泌系统与免疫系统互相影响，雌激素(E2)通过影响细胞因子分泌而影响免疫功能[1]。本研究通过观察小鼠雌激素受体水平及白细胞介素13(IL-13)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量在不同生理阶段的变化，了解雌激素水平对小鼠免疫功能的影响，为临床雌激素治疗对绝经妇女免疫功能的影响提供实验依据。

材料和方法

一、实验动物

清洁级健康雌性C57BL/6小鼠60只，其中2月龄40只，10月龄20只。由杭州师范大学动物实验中心提供(SYXK(浙)2016-0014)。

二、研究方法

1.小鼠发情间期、妊娠期和绝经期的判定：采用阴道细胞学检查，用小棉签蘸取少量生理盐水，擦取小鼠阴道内分泌物顺时针涂在载玻片上晾干，用95%酒精固定，经苏木精-伊红染色后于10×10倍光镜下观察。若显微镜下见有大量白细胞及少量有核细胞为发情间期[2]，全部是无核角化细胞或间有少量上皮细胞为发情期；发情期小鼠雌雄交配后，第2天观察阴栓形成为妊娠；于妊娠12～15 d取标本。13月龄小鼠，1天1次显微镜观察阴道分泌物涂片，连续5 d内呈现不规则动情周期者为绝经期[3]。所有小鼠3月后进行实验，实验前4 h采用Con A(10 mg/kg)尾静脉注射。

2.实验分组和取材：2月龄小鼠随机分为发情间期组、妊娠组，10月龄小鼠拟为自然绝经组，每组20只。其中妊娠组、自然绝经组为实验组，发情间期组为对照组。

3. RT-PCR检测：新鲜取得小鼠脾脏组织100 mg，经液氮冰冻后Trizol法提取总RNA用以待测IL-13 mRNA、TNF-α mRNA和ERα、ERβ mRNA，引物由上海生工生物有限公司合成，β-actin基因作为内参基因(引物见表1)。电泳法检测纯度，定量后取5 μg经特异性DNA酶消化后利用反转录试剂盒(美国BD公司)进行逆转录，-20℃保存备用。荧光定量PCR反应体系(美国BD公司)如下： 荧光标记染料2×SYBR Green I Master Mix 5 μl，Forward primer 0.2 μl，Reverse primer 0.2 μl，小鼠脾脏 cDNA 1 μl，灭菌三蒸水补至总体积10 μl。条件为：95℃2 min；95℃ 15 s、60℃ 10 s、72℃15 s，循环数39；72℃ 5 min。将以上PCR扩增试剂加入96 孔反应板中，3 000 r/min离心3 min，然后放入Bio-Rad CFX-384 荧光定量PCR 仪(Bio-Rad，美国)反应。反应结束后，应用SDS 分析软件(Applied Biosystems，美国) 进行分析。

表1 各引物序列

4.ELISA检测血清E2水平：取小鼠眼眶静脉血经离心后(3 000 r/min)取出血清，置于-80℃低温冰箱保存，采用双抗体夹心ELISA法检测各组血清E2(上海生工生物有限公司)水平。具体操作过程如下：待测样品孔加入样本40 μl，然后各加入抗E2抗体10 μl、链霉亲和素-HRP 50 μl，盖上封板膜，轻轻震荡混匀，37℃温育 60 min；每孔加满洗涤液洗涤重复3次；每孔加入显色剂100 μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 min；最后每孔加终止液50 μl终止反应，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)绘制标准曲线，分别计算各组标本E2含量。

三、统计学处理

结 果

一、各组小鼠血清E2水平比较

统计结果表明，与发情间期(对照组)小鼠[(55.23±5.11) pmol/L]比较，妊娠组小鼠血清E2水平[(82.27±8.70) pmol/L]显著升高，自然绝经组小鼠血清E2水平[(23.52±4.46) pmol/L]显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)

二、各组小鼠脾脏IL-13、TNF-α、ERα、ERβ mRNA水平的变化

与发情间期(对照组)小鼠脾脏ERα mRNA水平(2.70±1.17)比较，妊娠组脾脏ERα mRNA水平(3.93±1.54) 显著升高，自然绝经ERα mRNA水平(1.15±0.71)显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而三组之间ERβ mRNA水平无显著性差异(P>0.05)(图2)。

图1 三组小鼠的血清E2水平

图2 三组小鼠脾脏ERα、ERβ mRNA的表达水平

与妊娠组小鼠比较，发情间期组和自然绝经组小鼠脾脏IL-13、TNF-α mRNA相对水平显著升高，在自然绝经组小鼠脾脏表达最高，差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。

图3 三组小鼠脾脏IL-13、TNF-α mRNA的表达水平

讨 论

性激素补充治疗(Hormone Replacement Therapy，HRT)对改善围绝经期症状、预防骨质疏松和心血管疾病等的有益作用已毋庸置疑。理论上雌激素(E2)一直被认为是潜在致癌促进剂[3]，通过影响细胞增殖分化而促进肿瘤细胞生长。是否增加与性激素依赖有关的恶性肿瘤，以及此类患者在HRT 后是否会导致肿瘤复发等问题，长期以来存在广泛争议，相关研究表明性激素与妇女免疫功能关系密切，可能通过免疫系统影响肿瘤发生发展[4-7]。

TNF-α是由激活的单核巨噬细胞系列合成和释放的一种蛋白质，对维持机体内环境的稳定及组织更新改建起着重要调节作用。TNF-α是重要的内源性炎症性细胞因子，同时还是调节机体免疫功能和代谢过程的多功能细胞因子[8]。

人类IL-13具有多功能的作用，应答细胞包括单核吞噬细胞、B细胞、大颗粒淋巴细胞和内皮细胞。尤其IL-13通过激活单核细胞/巨噬细胞抑制促炎因子的合成，抑制单核巨噬细胞产生趋化因子(IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、MIP-1、IFN-q、TNF-α和G-CSF等)。IL-13具有调节单核/巨噬细胞活性的功能[9]，IL-13激活单核细胞和巨噬细胞通过诱导环氧化酶-2下调前列腺素。

机体内环境是复杂的稳态结构，E2需与受体结合后才能发挥作用，因此不同的E2效应除了自身浓度差异以外，还与组织细胞上受体亚型及功能状态不同抑或其他细胞因子的间接效应有关[10]。本研究通过检测不同生理阶段小鼠中E2水平，ERα、ERβ mRNA 表达及多种免疫学指标、细胞因子的水平，以观察体内生理水平E2及相应受体功能状态对是否对各项免疫指标产生影响。本研究发现妊娠组血清E2水平明显高于对照组(P<0.05)，自然绝经组显著低于对照组(P<0.05)，妊娠组血清ERα mRNA水平明显高于对照组(P<0.05)，自然绝经ERα mRNA明显组低于对照组(P<0.05)；而三组ERβ mRNA水平无明显差异(P>0.05)，提示E2与ERα结合发挥作用，与Pierdominici等[11]实验结果一致。

细胞因子是调控蛋白质，由不同类型的细胞产生，经自分泌，内分泌和旁分泌形式参与对外界刺激的反应。绝经后E2的骤然下降影响细胞因子的产生[12-13]。夏贤等[6-7]发现对绝经妇女补充E2能明显提高T 细胞表面ERα表达，增强CD4+T 细胞作用，达到免疫平衡状态。TNF-α、IL-13是机体内两种重要的多功能细胞因子，主要由激活的巨噬细胞分泌，两者相互促进，并与其它细胞因子相互调节。绝经期妇女体内IL-13、TNF-α水平升高，并且机体对此类细胞因子反应亦增加，诱导妇女冠心病发生[14]，加速老龄化妇女骨质丢失，与绝经后骨质疏松有关[15]。本实验结果显示小鼠脾脏IL-13、TNF-α mRNA相对水平表达发情间期组较妊娠组水平高(P<0.05)，三组小鼠脾脏IL-13、TNF-α mRNA相对水平在自然绝经组表达最高(P<0.05)，提示当小鼠处于自然绝经期，E2下降，IL-13、TNF-α mRNA因子相对水平分泌升高，而年轻时期IL-13、TNF-α mRNA因子水平分泌降低，提示E2对IL-13、TNF-α因子水平的作用可能有影响，E2是否对机体其他免疫因子的影响及其机制仍需进一步实验证实。

【参考文献】

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