“培土生金法”早期干预改善支气管哮喘模型幼鼠气道炎症反应的机制

梁丹丹， 刘华， 欧阳学认， 周娟， 张芹欣， 黄丽，钟如帆， 刘媛， 宋文才， 孙少丹， 陈晓刚

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州510405）

支气管哮喘（简称哮喘）是儿童期最常见的呼吸道疾病之一，以慢性气道炎症和气道高反应性为特征.近年来，婴幼儿期的哮喘发病率呈显著上升趋势，且较年长儿更难诊断鉴别与预防控制，所以受到越来越多的重视[1].吸入糖皮质激素（inhaled corticosteroid，ICS）、白三烯受体拮抗剂（leukotriene receptor antagonists，LTRAs）等治疗，虽然有助于控制儿童哮喘的症状发作及改善肺功能，但并不能改变疾病的自然病程.尤其需要注意的是，对于婴幼儿期反复喘息的患儿，ICS及LTRAs的具体使用方法仍存在较大争议[2－3].因此，如何更有效地早期防治婴幼儿哮喘，是目前儿科临床的热点和难题.本实验在中医“肺脾相关”理论的指导下，通过动物实验，研究“培土生金”法的代表方剂—异功散早期干预以改善哮喘模型幼鼠气道炎症反应的作用，以探索中医药防治儿童哮喘的药理机制.

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级BALB/c雌性幼鼠，7日龄，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证标号：SYXK（粤）2013－0092.喂养条件保持室温21～25℃，相对湿度50%～70%.喂养过程中幼鼠自行摄食及饮水.

1.2 药物及主要试剂

鸡卵清蛋白（ovalbumin，OVA），购自于美国Sigma公司.白细胞介素 10（interleukin 10，IL-10）、转化生长因子-β1（transforming growth factorbeta1，TGF-β1）及白细胞介素-17（interleukin 17，IL-17）的酶联免疫吸附（ELISA）实验试剂盒，均购自于森贝伽（南京）生物科技有限公司.异功散由人参（Panax ginseng C.A.Mey）、白术（Atractylodes macrocephala Koidz.）、茯苓（Poria cocos（Schw.）Wolf）、广陈皮（Citrus reticulata Blanco）、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）按1∶1∶1∶1∶1比例配成，由广州中医药大学第一附属医院中药房提供，制成水煎剂，并配成含生药质量浓度为1 g/mL的溶液.常乐康胶囊（酪酸梭状芽孢杆菌/婴儿型双歧杆菌二联活菌）由山东科兴生物制品有限公司提供.

1.3 主要仪器

C28-NSET8 C型简易雾化器，欧姆龙（大连）有限公司；自制20 cm×20 cm×30 cm的密闭容器；AE-200电子分析天平，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；3K30低温高速离心机，美国sigma公司；电热恒温水温箱，上海跃进医疗器械厂；Multiskan MK3酶标仪，美国 Thermo公司；LEICA RM2255切片机，德国 LEICA公司；BX50F-3型OLYMPUS显微镜，日本奥林巴斯公司；YABO200漂烘片机，常州市雅博电子设备有限公司；LEICA AUTO STAINER XL全自动染片机，德国LEICA公司；CMIAS系列多功能真彩分析系统（北京麦克奥迪图像技术有限公司）.

1.4 分组、造模及给药

幼鼠适应性饲养3 d后，按简单随机分配法分为6组：正常对照组、模型对照组、异功散高剂量组、异功散中剂量组、异功散低剂量组及益生菌组，每组各10只.造模过程由致敏和激发两个阶段组成：致敏阶段，所有幼鼠于第1天和第13天行腹腔注射，除健康对照组注射生理盐水0.2 mL外，其余幼鼠均注射致敏液0.2 mL（质量分数为10%OVA溶液0.1 mL与等体积佐剂液态铝混合）；激发阶段，于第19～24天将致敏小鼠置于20 cm×20 cm×30 cm密闭容器内雾化吸入20 min，除正常对照组雾化吸入生理盐水外，其余幼鼠均雾化吸入质量分数为3%的OVA溶液，每日1次.激发后幼鼠出现烦躁不安或安静少动、喷嚏频繁、抓鼻、弓背、前肢缩抬、呼吸急促、喘息及腹部内凹等，视为哮喘造模成功.

各组均自造模当天起，以1次/d连续经口灌药至造模结束，共24 d；其中异功散高、中、低剂量组按《实验药理方法学》[4]动物与人药物剂量换算方式分别以人剂量的2倍、1倍、0.5倍给予每只每次 20 g/kg、10 g/kg、5 g/kg的异功散水煎液，益生菌组每只每次以常乐康菌粉420 mg（含婴儿双歧杆菌活菌数不低于1.0×106CFU/g，酪氨酸梭状芽孢杆菌不低于 1.0×107CFU/g），均稀释为25 mL/kg后，用新生儿留置针经口灌服，模型对照组与正常对照组则灌服等量生理盐水.

1.5 标本采集与指标检测

（1）标本采集：末次激发24 h后麻醉处死幼鼠，取仰卧位，打开胸腔，暴露气管及肺组织，分离肺组织，结扎右侧主支气管，用留置针行气管插管，用0.3 mL生理盐水灌洗左肺3次，支气管肺泡灌洗液（BALF）3 000 r/min离心 5 min，取上清液装于EP管中，－80℃保存，待测细胞因子.

（2）肺组织病理观察：取未灌洗的右侧肺组织用体积分数为4%多聚甲醛固定常规脱水包埋，切片后行苏木精－伊红染色法（hematoxylineosin staining，HE）染色，在镜下观察肺组织病理学变化，并根据Underwood标准进行评分[5]（表1）.

表1 Underwood组织病理学评分标准Table 1 Underwood histopathological criteria

（3）BALF中细胞因子 IL-10、TGF-β1、IL-17的检测：采用ELISA法测定，具体操作按试剂盒说明书进行.

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计分析，计量资料以（均数±标准差）（±s）表示.符合正态分布用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较，方差齐性用LSD方法；不符合正态分布者用秩和检验进行.以P＜0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 一般情况

正常对照组幼鼠活动、饮食及大便均正常，背毛光亮，体质量增长迅速.其余各组幼鼠则出现不同程度的烦躁不安或安静少动、抓耳挠鼻、前肢抬缩、弓背、呼吸加快、喘息、腹部内凹、腹泻、背毛稀疏不光泽及体质量增长较正常组减慢等表现.实验结束后，共剩余51只幼鼠.其中正常对照组平均体质量（17.87±0.71）g、异功散低剂量组平均体质量（14.89±1.44）g及益生菌组平均体质量（16.47±3.31）g，分别死亡1只；模型对照组平均体质量（15.95±1.39）g、异功散高剂量组平均体质量（15.99±1.97）g及异功散中剂量组平均体质量（15.45±1.41）g，则分别死亡2只.

2.2 肺组织病理变化

正常对照组仅见个别细支气管周围少量慢性炎症细胞浸润，未见明显组织损伤及显著水肿，支气管上皮细胞完整，未见脱落.模型对照组则可观察到细支气管周围及肺间质内重度炎症细胞浸润，浸润细胞包括淋巴细胞、浆细胞及中性粒细胞，并见小脓肿形成，组织坏死，局灶区域肺泡腔内可见粉染液体渗出，支气管上皮粘液细胞增多和管腔内可见粘液样分泌物.异功散高、中、低剂量组的的炎症细胞浸润、组织损伤、水肿及上皮细胞脱落程度等，则较模型对照组依次减轻，见图1.

模型对照组的Underwood评分显著高于正常对照组（P＜0.01），而益生菌组及异功散高、中、低剂量组则均显著低于模型对照组（P＜0.01），见表2.

图1 各组肺组织病理变化Fig.1 Pathological changes of lung tissue in each group

表2 各组肺组织HE染色的Underwood评分Table 2 Underwood score of HE staining in lung tissues of each group （±s）

表2 各组肺组织HE染色的Underwood评分Table 2 Underwood score of HE staining in lung tissues of each group （±s）

与模型对照组比较：1）P＜0.01.

组别 n HE染色正常对照组 9 0.22±0.441）模型对照组 8 3.63±1.19益生菌组 9 1.22±0.441）异功散高剂量组/（20 g·kg－1） 8 1.50±0.541）异功散中剂量组/（10 g·kg－1） 8 1.75±0.461）异功散低剂量组/（5 g·kg－1） 9 1.89±0.931）

2.3 BALF中细胞因子 IL-10、TGF-β1、IL-17含量的比较

模型对照组BALF中的IL-10含量显著低于正常对照组（P＜0.01），而 TGF-β1含量虽低于正常对照组，IL-17含量高于正常对照组，但均无统计学差异.益生菌组与异功散高、中、低剂量组BALF中的IL-10含量均显著高于模型对照组（P＜0.01，P＜0.05）.益生菌组与异功散高、中、低剂量组BALF中的TGF-β1含量均高于模型对照组，其中益生菌组与异功散高、低剂量组有统计学差异（P＜0.01，P＜0.05）.益生菌组与异功散高、中、低剂量组BALF中的IL-17含量均低于模型对照组，但均无统计学差异（P＞0.05），表3.

表3 各组BALF中细胞因子的质量浓度Table 3 Concentration of cytokine in each group of BALF（±s）/（pg·mL－1）

表3 各组BALF中细胞因子的质量浓度Table 3 Concentration of cytokine in each group of BALF（±s）/（pg·mL－1）

与模型对照组比较：1）P＜0.01，2）P＜0.05.

组别 n ρ（IL－10） ρ（TGF－β1） ρ（IL－17）正常对照组 9 2.58±0.371）2.52±0.52 2.03±0.29 2.54±0.42模型对照组 8 1.97±0.15 1.73±0.19 2.63±0.45益生菌组 9 2.72±0.451） 2.16±0.432） 2.50±0.51异功散高剂量组 8 2.35±0.232） 2.22±0.471） 2.21±0.47异功散中剂量组 8 2.40±0.312） 1.94±0.29 2.33±0.39异功散低剂量组 9 2.53±0.401） 2.15±0.312）

3 讨论

中医药治疗哮喘有其独特的优势.中医学认为伏痰留饮是哮喘发作的关键病理因素，然其形成与脾脏关系密切.肺脾两经同属“太阴”，在气血津液的生成、气机调畅及水液代谢方面呈现出相互依赖、相互协调的关系，《医方集解·补养之剂第一》载“脾者，万物之母也，肺者，气之母也，脾胃一虚，肺气先绝”.因此“肺脾相关”理论对肺系疾病的诊断及治疗有重要的指导意义.小儿具有“脏腑娇嫩，形气未充”的生理特点，临床所见小儿哮喘单纯肾虚者较少，而其“肺常不足”、“脾常虚”的生理、病理特点更显突出.因此，“培土生金法”也相应成为防治儿童哮喘的重要治法，广泛用于哮喘缓解期的治疗.异功散是北宋儿科名医钱乙在补气基本方—四君子汤基础上加陈皮而成，补气而不壅滞，尤其符合小儿“脾常不足”的特点，故自创制以来，一直被推崇为调理小儿脾胃的经典方剂，各地儿科名家更大量应用于哮喘的防治[6－7]，但其药理作用机制迄今尚未明确.

对于支气管哮喘的发病机制，传统的辅助性T淋巴细胞1型（Th1）/辅助性T淋巴细胞2型（Th2）平衡失调的理论已难以完整解释，近年来的研究则证实CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞（Treg）和辅助性T细胞17型（Th17）也与之密切相关[8].作为机体免疫反应程序中关键的调节因素，Treg细胞能通过各种机制诱导机体对自身抗原和过敏原产生免疫耐受，例如其分泌的细胞因子 IL-10和 TGF-β，可抑制 T细胞的增殖及Th1、Th2的细胞因子反应[9].Th17细胞则可分泌IL-17，刺激上皮细胞分泌趋化因子，促进中性粒细胞浸润，加重气道炎症反应，使气道反应性增高[10].因此，Treg/Th17的免疫失调是导致哮喘等过敏性疾病发生的重要机制.另一方面，生命早期的微生物则能直接影响Treg和Th17细胞的发育，对机体建立正常的肠道菌群—黏膜免疫至关重要[11].研究发现，双歧杆菌（Bifidobacterium）、乳杆菌（Lactobacillus）等共生菌则能上调体内Treg的水平，纠正失衡的 Treg/Th17[12－13]，甚至防治模型小鼠的哮喘[14].

本研究小组推测“培土生金法”及其代表方剂—异功散防治哮喘的作用，可能与其通过影响肠道菌群—黏膜免疫，进而调节Treg/Th17细胞的功能相关.本研究发现，与益生菌类似，异功散的早期干预，减轻了哮喘模型幼鼠的气道炎症反应，且其疗效呈现出剂量相关性的差异，提示异功散可有效防治哮喘的过敏性炎症.研究结果还表明，异功散的早期干预提高了模型幼鼠肺泡灌洗液中相关细胞因子IL-10的含量，提示上述防治作用可能与其影响Treg细胞的功能有关.然而，由于异功散对Treg细胞相关细胞因子的作用并未呈现出剂量差异；另一方面，异功散各剂量组与正常对照组，较模型对照组的IL－17也未发现明显差异，故异功散影响Treg/Th17平衡的具体途径，仍有待进一步研究.

[参考文献]

[1]QU CX，ZHANG ZK.Current views of pediatric asthma[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（4 Suppl）：106－108.

[2]ABRAMS E M，SZEFLER S J，BECKER A B.Does inhaled steroid therapy help emerging asthma in early childhood？[J]. The Lancet Respiratory Medicine，2017，5（10）：827－834.

[3]RAISSY H H，KELLY H W.Benefits and risks of longterm asthma management in children：where are we heading？[J].Drug Saf，2017，40（3）：201－210.

[4]魏伟.实验药理方法学[M].第4版.北京：人民卫生出版社，2010：1698.WEI W.Experimental Methodology of Pharmacology[M].4th ed.Beijing：People's Medical Publishing House，2010：1698.

[5]UNDERWOOD S，FOSTER M，RAEBURN D.Timecurse of antigen-induced airway inflammation in the Guinea pig and its relationship to airway hyperresponsiveness[J].Eur Rrespir J，1995，8（12）：2104－2113

[6]王明明.汪受传教授治疗小儿肺系疾病经验[J].中华中医药杂志，2011，26（11）：2602－2604.WANG MM.Professor WANG Shou-chuan's experience in treating pediatric lung system diseases[J].China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy，2011，26（11）：2602－2604.

[7]谭惠元.吴曙粤教授治疗小儿哮喘的经验介绍[J].广西中医药，2015，38（3）：42－43.TAN H Y.Professor Wu Shuyue's experience in treating childhood asthma[J].Guangxi Journal of Traditional Chinese Medicine，2015，38（3）：42－43.

[8]覃雪军，银维谋，谭毅.调节性T淋巴细胞与Th17细胞在哮喘气道炎症中的作用[J].中国临床新医学，2015，8（10）：996－1000.QIN X J，YIN W M，TAN Y.Treg/Th17 Paradigm in asthmatic airway inflammation[J].Chinese Journal of New Clinical Medicine，2015，8（10）：996－1000.

[9]NOVALRIVASM，CHATILA TA.Regulatory T cells in allergic diseases[J].JAllergy Clin Immunol，2016，138（3）：639－652.

[10]COSMI L， LIOTTA F， ANNUNZIATO F. Th17 regulating lower airway disease[J].Curr Opin Allergy Clin Immunol，2016，16（1）：1－6.

[11]MCLOUGHLIN R M，MILLS K H. Influence of gastrointestinal commensal bacteria on the immune responses thatmediate allergy and asthma[J].JAllergy Clin Immunol，2011，127（5）：1097－1107.

[12]KONIECZNA P，GROEGER D，ZIEGLER M，et al.Bifidobacterium infantis 35624 administration induces Foxp3 T regulatory cells in human peripheral blood：potential role formyeloid and plasmacytoid dendritic cells[J].Gut，2012，61（3）：354－366.

[13]de ROOCK S，van ELK M，van DIJK ME，et al.Lactic acid bacteria differ in their ability to induce functional regulatory T cells in humans[J].Clin Exp Allergy，2010，40（1）：103－110

[14]刘梦昀，郑跃杰，黄建琼，等.婴儿型双歧杆菌对哮喘小鼠气道炎症的作用研究[J].中国微生态学杂志，2015，27（8）：881－885.LIU MY，ZHENG Y J，HUANG J，Q，et al.The effects of Bifidobacterium in fantis on the airway in flammation in murine models of asthma[J].Chinese Journal of Microecology，2015，27（8）：881－885.