鸢尾丝囊霉（Aphanomyces iridis）引起的烟草漂浮苗根腐病的初步报道

李小杰，李淑君，李成军，胡亚静，康业斌，邱睿，陈奇园，白静科，陈玉国

1 烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室 河南省农业科学院烟草研究所，河南省许昌市魏都区永昌大道与青梅路交叉口 461000；2 河南科技大学林学院，河南省洛阳市天津路70号 471000

烟草苗期根茎类病害有猝倒病、立枯病、炭疽病、黑胫病、根黑腐病、镰刀菌根腐病等[1-5]，其中以猝倒病、立枯病、炭疽病发生较为普遍，给烟草苗床管理带来较大危害。1994年，陈瑞泰[1]报道由镰刀菌引起的烟草苗床根腐病在云南省苗床有发生，是一种具有潜在危害性的病害。

烟草漂浮育苗技术是全国烟区推广普及的一项新型实用育苗技术，对提高烟叶整体生产水平，提高烟叶质量起重要作用。随着漂浮育苗技术推广面积的扩大及其应用年限的增长，加之苗床管理不规范，近年来烟草漂浮苗根腐病的发生有逐年加重的趋势[6-8]，且病原种类也在不断增加。据报道，腐霉属中瓜果腐霉［Pythium aphanidermatum( Eds. ) Fitzp.］、终极腐霉(Pythium ultimumTrow) 和畸雌腐霉(Pythium irregulareBuismand ) 等可引起多种植物的根腐病，其中瓜果腐霉可引起烟草猝倒病[9-10]。2012年，劳超等[11]首次报道了由异丝腐霉引起烟草漂浮苗根腐病。李宏光等[12]从漂浮育苗中分离鉴定出5属6种导致烟苗根腐的细菌。2017年在河南省宝丰、泌阳、许昌、漯河等烟区烟草漂浮育苗过程中，烟苗出现生长缓慢、植株矮小、生长势差、叶色发黄等问题，浮盘下烟苗的根呈灰褐色，后腐烂死亡，发病严重的烟苗茎基部及底部叶片的叶脉出现褐色坏死，给烟苗生产带来了很大的威胁。为明确病原，同时为苗床病害的防治及苗床管理提供依据，本研究采集了具有代表性的病害样本，并对样本进行了病原菌分离、鉴定以及致病性测定。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2017年5月自平顶山宝丰、驻马店泌阳、许昌县、漯河临颍烟区苗床采集有代表性的疑似根腐病的病害样本共12个，进行病原物分离及鉴定。

1.2 病原菌分离及形态观察

采用PDA（马铃薯萄萄糖培养基）常规分离法进行病原菌分离，将洗净的新鲜病根或病茎剪成5 cm长的节段，无菌水浸洗4～5次，置PDA培养基上，25 ℃恒温光/暗（12 h/12 h）培养4～6 d，待菌落形成。切取菌落边缘部分置于新的PDA培养基上进行纯化，获得纯菌株后，转移到PDA培养基上，25 ℃恒温光/暗（12 h/12 h）培养7～15 d，显微镜下进行形态学观察。

1.3 病原的分子生物学鉴定

使用真菌基因组提取试剂盒提取分离菌的基因组DNA，用真核生物核糖体DNA通用引物ITS1/ITS4和18S rDNA引物NS1/NS6进行PCR扩增，其序列分别为ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’，NS6：5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’。引物由上海生工生物工程技术服务有限责任公司合成。PCR反应体系为25 μL：Taq 酶0.3 μL，10×Buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物各 0.5 μL（10 μM），模板 1 μL（50 ng/μL），加dd H2O 至25 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 4 min，94℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30 个循环，72 ℃延伸10 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并测序，测序结果在NCBI上进行Blast比对，选择同源性较高的序列用MEGA软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.4 病原菌回接试验

（1）漂浮苗水培接种法：从病组织上获得病菌的纯培养后，置于PDA培养基上，25 ℃恒温光/暗（12 h/12 h）培养12 d，制备孢子悬浮液，调整浓度约为1×106个/mL。将中烟100漂浮苗置于孢子悬浮液中，置25 ℃、黑暗/光照为12 h/12 h的人工气候箱中培养，以无菌水做对照。5～7 d后，观察发病情况。

（2）盆栽灌根接种法：选苗龄为4～5真叶健康的中烟100烟苗，用灭菌的手术刀对根系造成伤口，移栽至直径为10 cm的花盆中，每株灌20 mL孢子悬浮液（浓度同上），以无菌水接种做对照。5～7 d后，观察发病情况。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离及形态学观察

从采集到的12个疑似根腐病的病害样本中分离纯化获得具有代表性的真菌菌株10个（图1），编号分别为 BF-2、BF-3、BF-4、BF-5、BF-6、BY-1、BY-2、LH-3、LH-5、XC-1。

图1 样品采集照片Fig.1 Photos of sample collection

10个菌株的形态学观察结果表明，菌落生长茂盛，气生菌丝白色棉絮状（图2A），光学显微镜下（400倍），菌丝无色，无隔膜，直径2.5～12.5 μm，平均约8.2 μm；孢子囊顶生，由球形膨大菌丝形成，无乳突，直径17.5～32.5 μm，平均约24.1 μm；藏卵器顶生，短柄，球形。卵孢子球形、透明，具有双层厚壁，直径22.5～32.5 μm，平均约26.4 μm（图2B、C）。

图2 分离菌在PDA培养基上的培养性状及病原形态特征Fig.2 Characteristics and pathogenic morphology of isolated Fungus on PDA medium

2.2 病原菌的分子生物学鉴定

通过Blast，10个菌株ITS区段的比对结果表明（图3），所分离纯化得到的10个菌株与NCBI数据库中鸢尾丝囊霉（Aphanomyces iridis）序列同源性均为99%，且位于同一分支。

图3 分离菌的系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree of the isolated Fungus

2.3 病原菌的回接试验

选取代表性菌株进行漂浮苗及盆栽接种试验，结果表明（图4），与对照相比，烟苗在分别接种菌株BF-2和BF-5后7 d，根部出现褐色变软坏死，根系少，下部叶片发黄，茎基部和底部叶片的叶脉处形成褐色坏死斑，甚至全株萎焉。将发病组织在PDA培养基上进行分离培养，也同样得到丝囊霉菌，说明所分离到的丝囊霉菌具有致病性，表明鸢尾丝囊霉可引起烟草漂浮苗根腐病。

图4 分离菌的致病性测定Fig.4 Pathogenicity test of the isolated Fungus

3 结论与讨论

丝囊霉属(Aphanomyces)属于鞭毛菌亚门真菌，是卵菌纲、水霉目、水霉科中的一属，常见的水霉科真菌还包括绵霉属、水霉属等，其中有些种类是引起稻苗绵腐病和鱼类水霉病的病原菌[13-14]。由丝囊霉属真菌引起的植物病害在国内外均有报道。1940年，Weime发现根腐丝囊霉菌（Aphanomyces euteiches）和一种镰刀属真菌（Fusariumsp.）侵染箭筈豌豆，引起根腐病[15]。1974年，日本首次发现丝囊霉属真菌引起的荷兰鸢尾基腐病，又称黄化腐败病，其病原为鸢尾丝囊霉（Aphanomyces iridisIchitani &Kodama）[16]。在我国甘肃河西灌区，由黑腐丝囊霉（Aphanomyces cochlioides）引起的甜菜黑腐病是一种重要病害[17]。另外，在我国福建、青海和甘肃地区，根腐丝囊霉（Aphanomyces euteichesDrechs）可引起豌豆的根腐病[18-20]。但是目前尚未有关于丝囊霉属真菌引起的烟草根部病害的报道，本文是丝囊霉属真菌引起烟草根腐病的首次报道。

根据生产中采集到的苗床病株症状和本文接种症状，本研究基本明确了由鸢尾丝囊霉引起的烟草漂浮苗根腐病的典型症状为：感病烟苗生长缓慢、植株矮小、叶色发黄、根部呈现褐色变软坏死、根系少，病症可向上扩展至茎基部和底部叶片，形成褐色坏死斑，严重的致全株萎焉。该病症状与瓜果腐霉引起的烟草苗期猝倒病的主要区别表现在前者除有根腐的病状外，一般不会出现植株倒伏的现象。同时也有报道异丝腐霉引起烟草漂浮育苗根腐病[11]，但该病与鸢尾丝囊霉引起的根腐病的主要区别在于，前者只有根腐的症状并不危及茎部，而后者往往会向上扩展至茎部和底部叶片，出现褐色坏死。

丝囊霉属真菌可在土壤中营腐生生活，以卵孢子和菌丝体在土壤中越冬。该病害的发生与土壤水分关系密切，低温高湿有利于该病害的发生[16,21]，这与烟草猝倒病的发生条件基本一致，而与烟草立枯病的发病条件有一定差异[3,22]。因此，在漂浮育苗过程中应注意做好基质和水源的杀菌、消毒工作，同时加强和规范苗床管理，注意适当对烟苗进行控水处理。

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