EP2受体激动剂Butaprost对奶牛子宫内膜上皮细胞中血管内皮生长因子基因表达的影响

包海霞 ，高 龙 ，2，毛 伟 ，2，刘 博 ，2，钱英红 ，曹金山 ，2

（1.内蒙古农业大学，内蒙古 呼和浩特 010018；2.农业部动物临床诊疗技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；3.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

前列腺素（prostaglandins，PGs）类化合物是广泛存在于哺乳动物机体内的一种重要的生理活性物质，能够对体内多种生殖相关活性物质的分泌产生调控作用。目前，研究发现存在于奶牛子宫内膜中的PGs主要包括前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2） 和前列腺素F2α（prostaglandin F2α,PGF2α）。 PGE2通过与其受体 EP1、EP2、EP3和 EP4结合，激活其介导的信号转导通路，进而发挥其生物学效应［1］。 张双翼等［2］研究发现，奶牛子宫内膜组织中EP2和EP4受体的表达量较高，说明在奶牛子宫内膜组织中EP2和EP4受体主要介导了PGE2发挥其生物学效应。

研究发现，在人子宫内膜的修复过程中，PGE2和PGF2α能够上调与血管生成有关的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、与细胞增殖有关的结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）以及具有血管再生作用的白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）的表达。 由此可知，PGE2和PGF2α在人子宫内膜的修复过程中发挥重要的作用［3-5］。但是，关于奶牛子宫内膜中PGs是否在其子宫内膜组织的修复过程中发挥重要作用的相关机制研究尚不清楚。因此，该研究以奶牛子宫内膜上皮细胞为研究对象，研究了PGE2特异性受体EP2激动剂Butaprost对与血管生成相关细胞因子的VEGF表达的影响，阐明PGE2是否在奶牛子宫内膜组织的修复中发挥重要的作用，为进一步研究PGs对奶牛子宫内膜组织的修复作用提供了一定的理论依据。

表1 RT-PCR中的受体引物序列及扩增片段大小

1 试验材料

1.1 奶牛子宫角

奶牛子宫角采集自呼和浩特市北亚清真屠宰场，选取成年健康并且处于发情前期的奶牛进行样本组织采集。将采集到的子宫角浸泡在含5%双抗的低温生理盐水中迅速带回实验室。

1.2 药品与试剂

DPBS 洗液 （Hyclone）， 链蛋白酶（Sigma），DMEM/F12 培养基（GIBCO），青链霉素（GIBCO），胎牛血清（ExCell Biolog），胰酶（GIBCO），EP2受体激动剂 Butaprost（Cayman），RNA提取试剂盒(Axygen Scientific），反转录试剂盒（Vazyme），SYBR Ⅱ Premix Ex Taq(TaKaRa)，Actin（碧云天生物技术有限公司）；其他试剂均为国产或进口分析纯。

2 方法

2.1 奶牛子宫内膜上皮细胞的分离培养

按照文献［6］中的方法分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞。

将奶牛子宫内膜上皮细胞培养至第4代用于试验。观察活细胞数量达96%以上，采用Cytorecon细胞计数仪进行计数，以1×105个/mL的浓度接种于6孔板中，置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养待用。

2.2 分组与给药

按照文献［6］中的研究结果选取Butaprost浓度为10-6mol/L。

试验共分为7组：①对照组（Con），未加药物作用的奶牛子宫内膜上皮细胞；②10-6mol/L的Butaprost作用2 h组；③10-6mol/L的Butaprost作用4 h组；④10-6mol/L的Butaprost作用8 h组；⑤10-6mol/L的Butaprost作用16 h组；⑥10-6mol/L的Butaprost作用24 h组；⑦10-6mol/L的Butaprost作用48 h组。

2.3 Butaprost对奶牛子宫内膜上皮细胞中VEGF mRNA表达的影响

2.3.1 引物设计合成：利用Primer 6.0通过Gen-Bank上报道的VEGF基因序列设计合成引物并由Invitrogen公司合成（引物序列见表1）。

2.3.2 总RNA的提取：按照总RNA提取试剂盒提供说明书提取细胞总RNA。

2.3.3 cDNA的制备：按照Vazyme试剂盒说明书设定条件获得cDNA。

2.3.4 RT-PCR检测奶牛子宫内膜上皮细胞中VEGF mRNA的表达

以上述制备的cDNA为模板，利用GenBank合成的引物，通过RT-PCR方法扩增得到目的基因。 反应条件是：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，设置38个循环，每个样品设置5～6个重复。

3 结果

结果见图1。由图1可知，EP2受体激动剂Butaprost（10-6mol/L）作用奶牛子宫内膜上皮细胞2、4、8、16、24、48 h 后 VEGF mRNA 表达量与对照组相比，在 8 h 表达量极显著增强（P＜0.01，n=6）；在 4、16、24 h 表达显著增强（P＜0.05，n=6）；其他时间有所增加，但差异性不显著。由此可知，EP2受体激动剂Butaprost能够促进奶牛子宫内膜上皮细胞中VEGF基因的表达。

图1 BUTAPROST对奶牛子宫内膜上皮细胞VEGF mRNA表达的影响

4 讨论

组织修复是一个非常复杂的过程，主要经历3个阶段：①局部炎症反应阶段；②细胞增殖分化和肉芽组织生成阶段；③组织修复塑形阶段。在修复过程中，许多炎性因子和细胞生长因子参与其中。VEGF也称血管通透因子，是一种在血管发生和血管生成过程中起到关键作用的调控因子［7-8］。VEGF还可以增强血管的通透性，可以促进细胞迁移、有效地抑制细胞凋亡［9-11］。除此之外，VEGF还可以促进神经细胞的增殖［12］。因此，该研究采用荧光定量PCR技术检测了EP2受体激动剂Butaprost对奶牛子宫内膜上皮细胞中VEGF mRNA表达的影响。研究结果显示，Butaprost能够促进奶牛子宫内膜上皮细胞中VEGF mRNA表达。综合以上研究结果可知，奶牛子宫内膜上皮细胞内源性PGE2可通过与EP2受体结合，激活其介导的信号转导通路，提高VEGF基因的表达，进而在奶牛子宫内膜的修复过程中发挥重要的作用。

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