Salen-Mn通过阻滞TGF-β/Smad2信号通路抑制肾细胞癌786-O细胞的侵袭迁移

寇 博,寇青山,刘 伟

(1西安交通大学医学部第一附属医院心血管外科,西安 710061;2咸阳市第一人民医院体检中心;3西安交通大学医学部第一附属医院血管外科;*通讯作者,E-mail:lizhang 1988617@163.com;#共同通讯作者,E-mail:821957325@qq.com)

肾细胞癌是最为常见的肾癌类型,占人类恶性肿瘤的3%[1]。由于肾细胞癌对放化疗均不敏感,这已成为治疗转移性肾癌的一大障碍。而上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肿瘤侵袭转移的特征之一,是指细胞失去上皮性特征,而获得间质特征的一个复杂过程[2]。在上皮间质转化过程中,癌细胞可由原发病灶,通过血管和淋巴管道侵及远隔组织。且EMT过程中常伴随有上皮性指标E-cadherin和ZO-1的下调,以及间质性指标N-Cadherin,Snail等的上调[3,4]。鉴于晚期肾癌的难治性,有必要寻找新型的抗肿瘤药物来治疗肾癌。

Salen是指含有两个碳氮双键的一类化合物,其可以和锌、铁等多种不同金属离子形成金属配合物。而金属-salen配合物的形成,可以提高生物活性,同时降低自身的毒性。文献报道salen配合物具有抑癌、抗病毒等生物学功能,但是金属-salen配合物在肾癌中的研究并无相关报道,且其对肿瘤侵袭转移的作用亦尚无报道。本研究旨在探究salen-Mn(锰-双希夫碱复合物)对肾细胞癌侵袭转移的作用及其机制,期望能为salen-Mn的临床用药提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和主要试剂

人肾细胞癌786-O细胞为西安交通大学第一附属医院公共平台实验室保有,Salen-Mn由西安交通大学药学院新近合成。1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司,Transwell小室购于美国Millcell公司,X-tremeGene DNA转染试剂购自Roche公司,单克隆抗体E-cadherin、Vimentin、Snail、TGF-β、p-Smad2、Smad2和β-actin购自美国CST公司,PCR引物、反转录试剂盒均由日本Takara公司合成。

肾癌细胞常规用含10%胎牛血清的1640培养基培养,培养基预先加入青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 U/ml),在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。细胞需间隔2-3 d换液,待细胞密度长至80%-90%可传代。

1.2 MTT实验检测细胞增殖能力

肾细胞癌786-O细胞经消化重悬后以每孔1×104个接种到96孔板内,并设置5个复孔。待细胞密度长至90%左右时给予不同浓度的salen-Mn处理(0.5,1.25,2.5,5,10,20 μmol/L),在37 ℃细胞培养箱继续培养24 h，随后每孔加入含20 μl MTT和180 μl 培养基的混液并继续培养4 h,弃去废液后每孔加入150 μl DMSO并在漩涡振荡器振荡10 min,最后在490 nm波长下检测细胞的OD值。

1.3 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

细胞经胰酶消化重悬后接种到6孔板内,待细胞密度长至90%后,用灭菌PBS缓冲液清洗,并用200 μl枪头沿直线划痕,随后加入2 ml无血清培养基并作相应处理,处理24 h然后在显微镜下观察并拍照。

1.4 Transwell迁移实验检测细胞迁移能力

细胞经胰酶消化后,用无血清1640培养基重悬,并用计数板计数。将Transwell小室置于24孔板内,其上室加入200 μl含2×104的786-O细胞,并加入salen-Mn处理,而24孔板内则加入800 μl含10%胎牛血清的1640培养基。随后在37 ℃细胞培养箱内培养24 h,用4%多聚甲醛固定10 min,0.1%结晶紫染液染色10 min,PBS缓冲液清洗后,用棉签擦拭Transwell上室,最后用倒置显微镜下观察,并选择5个随机视野拍照计数,作统计学分析。

1.5 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力

在Transwell上室预先加入60 μl的Matrigel混液(Matrigel ∶无血清培养基=1 ∶5),后续处理同Transwell迁移实验。最后通过倒置显微镜观察,并选择5个随机视野拍照计数,作统计学分析。

1.6 实时定量PCR检测基因转录水平的表达变化

细胞经处理后用Trizol法提取总RNA,定量后按照Takara反转录试剂盒说明书合成cDNA。PCR所需引物由日本Takara公司合成。引物序列为E-cadherin 正义5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′,反义5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′;N-cadherin 正义5′-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3′,反义5′-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3′;Vimentin 正义5′-GACGCCATCAACACCGAGTT-3′,反义5′-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3′;Snail 正义5′-TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3′,反义5′-AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3′;β-actin 正义5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,反义5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。通过实时定量PCR进行扩增,利用BioRad CFX Manager软件进行定量分析。

1.7 Western检测蛋白水平的表达变化

细胞经处理后用PBS缓冲液清洗,弃废液,用RIPA裂解液裂解细胞。离心后提取上清蛋白,并行蛋白定量。取15 μg变性蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳,用PVDF膜转膜2 h,5%脱脂奶粉封闭1 h,随后加入一抗(稀释比例均为1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜。然后TBST液洗膜3次,每次5 min,再室温孵育二抗(稀释比例1 ∶1 000)1 h。TBST液洗膜3次,每次5 min,滴加显影液(美国Bio-Rad公司)显影,用凝胶成像软件Image Lab(美国Bio-Rad公司)进行分析。

1.8 质粒转染用于靶基因的过表达

取两个1.5 ml无酶离心管,各加入100 μl无血清培养基,随后1个离心管内加入2 μg TGF-β质粒,另1个离心管内加入8 μl X-tremeGENE DNA转染试剂,吹打混匀后均静置5 min,随后两离心管内混液混匀再静置15 min,加入至6孔板内,补足培养基至2 ml,在培养箱内培养48 h,再做后续的细胞划痕、Transwell侵袭迁移以及Western等实验。

1.9 统计学分析

数据通过GraphPad 5.2软件进行分析,并用均值±标准差来表示。组间差异采用t检验,P<0.05视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Salen-Mn对肾癌细胞增殖的影响

首先通过MTT检测salen-Mn对肾癌细胞的增殖能力,以排除细胞增殖对salen-Mn的抗侵袭迁移能力影响。结果显示,salen-Mn能够抑制肾癌细胞的增殖,且呈剂量依赖性(见图1)。另外当salen-Mn的浓度≤5 μmol/L 时,其对肾癌细胞的抑制率小于10%,因此本研究选取 5 μmol/L作为salen-Mn在后续侵袭迁移研究的用药浓度。

2.2 Salen-Mn 对肾癌细胞侵袭迁移的影响

细胞划痕实验显示salen-Mn处理组的细胞划痕间距明显宽于未处理组的(见图2A)。Transwell迁移实验也显示salen-Mn处理组的迁移细胞数少于其对照组,这说明salen-Mn能够有效抑制肾癌786-O细胞的迁移能力(见图2B)。另外Transwell侵袭实验结果显示salen-Mn处理组的侵袭细胞数明显低于其对照组,且两者有统计学差异(P<0.05,见图2B)。这表明salen-Mn也能够抑制肾癌786-O细胞的侵袭能力。

A.肾癌细胞的细胞活性变化 B.生长抑制率图1 MTT实验检测Salen-Mn对肾细胞癌786-O细胞增殖的影响Figure 1 Effect of salen-Mn on the proliferation of human renal cell carcinoma 786-O cells

A.细胞划痕实验 B. Transwell迁移和侵袭实验 C. salen-Mn(5 μmol/L)对肾细胞癌786-O细胞迁移能力的影响 图2 Salen-Mn对肾细胞癌786-O细胞侵袭迁移的影响Figure 2 Effect of salen-Mn on migration and invasion of human renal cell carcinoma 786-O cells

2.3 Salen-Mn 对肾癌细胞EMT的影响

实时定量PCR显示salen-Mn能够增加E-cadherin的mRNA水平,同时下调N-Cadherin、Vimentin和Snail的mRNA水平,且均有剂量依赖性(见图3A)。随后Western blot进一步检测提示肾癌786-O细胞经salen-Mn处理后,细胞内E-cadherin蛋白水平明显升高,而N-Cadherin、Vimentin和Snail蛋白水平则会剂量依赖性的下降(见图3B)。说明salen-Mn能抑制肾癌786-O细胞的上皮间质转化。

图3 Salen-Mn对肾细胞癌786-O细胞上皮间质转化的影响Figure 3 Effect of salen-Mn on epithelial-mesenchymal transition of human renal cell carcinoma 786-O cells

2.4 TGF-β/Smad2信号通路在salen-Mn调控肾癌细胞EMT和侵袭迁移中的作用

本研究通过Western blot检测了TGF-β/Smad2信号通路蛋白在salen-Mn处理的786-O细胞内的表达,结果显示TGF-β和p-Smad2蛋白表达逐渐下调(见图4A)。随后用质粒转染技术过表达TGF-β,结果显示TGF-β的过表达可以逆转salen-Mn所引起的E-cadherin上调以及Vimentin的下调(见图4B)。随后细胞划痕实验和Transwell实验进一步显示过表达TGF-β可以一定程度上逆转salen-Mn对肾细胞癌786-O细胞的抗侵袭迁移作用(见图4C和D)。这提示salen-Mn 通过抑制TGF-β/Smad2信号通路进而抑制肾癌786-O细胞的上皮间质转化。

图4 TGF-β/Smad2信号通路参与了salen-Mn对肾癌786-O细胞EMT和侵袭迁移的调控 Figure 4 TGF-β/Smad2 signaling is involved in the regulation of salen-Mn on epithelial-mesenchymal transition, migration and invasion of human renal cell carcinoma cells

3 讨论

目前关于金属salen配合物在肿瘤中的研究较少,其主要是通过抑制肿瘤增殖以及诱导凋亡来发挥其抑癌作用的[5]。研究报道salen-Fe复合物可以抑制肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多种不同肿瘤细胞的增殖[6]。且salen-Fe复合物能在淋巴瘤中上调促凋亡蛋白harakiri的表达,从而诱导细胞的凋亡[7]。而研究证实salen-Mn可以诱导乳腺癌细胞胞核压缩,片段化,进而诱导凋亡的发生。但是salen-Mn在肾细胞癌中的作用却尚未被阐述,而在本研究中salen-Mn不仅对肾细胞癌的增殖有一定的抑制作用,其对肾细胞癌的侵袭转移也有拮抗作用[8]。且EMT作为侵袭转移的标志之一,在salen-Mn处理下有显著变化,E-cadherin的表达显著上调,而N-Cadherin、Vimentin和Snail的表达则显著下调,这说明salen-Mn可以抑制肾癌细胞的上皮间质转化。

文献报道多条信号通路参与了对EMT的调控。Hedgehog-Gli信号通路在卵巢癌中可以调控EMT[9]。而Wnt/β-catenin通路被报道可以在口腔鳞状上皮癌中促进EMT[10]。也有研究显示salen-钯复合物能够增强TGF-β的mRNA水平[11]。本研究显示Salen-Mn可以抑制TGF-β以及p-Smad2的表达,且salen-Mn所引起的E-cadherin上调和Vimentin的下调可以被TGF-β的过表达所逆转。此外TGF-β的过表达可以逆转salen-Mn对肾细胞癌786-O细胞侵袭迁移的抑制作用,这表明salen-Mn可以通过抑制TGF-β/Smad2通路来发挥其抗侵袭转移的作用。而通过体内实验证实salen-Mn对膀胱癌侵袭迁移的抑制作用是后续研究的重点。

总而言之,salen-Mn能够抑制肾细胞癌786-O细胞的侵袭迁移,并逆转肾细胞癌上皮间质转化过程。且salen-Mn极有可能是通过下调TGF-β/Smad2信号通路来抑制肾癌细胞的侵袭转移作用。

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