胃癌中BDNF的表达特征及其临床意义

窦维佳,王景杰,刘震雄

(中国人民解放军空军军医大学(第四军医大学)唐都医院消化内科,西安 710038;#共同第一作者;*通讯作者,E-mail:liuzhx816@126.com)

尽管近年来发病率有所下降,胃癌仍是消化道最为常见的恶性肿瘤之一,是导致死亡的第二大恶性肿瘤,然而其发病机制尚不十分清楚[1]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)属于神经营养因子家族成员,在神经元的生长、分化与维持方面发挥着重要的调节作用[2,3]。近年研究发现,BDNF参与了肿瘤发生发展的病理生理过程,其在神经母细胞瘤、胰腺导管癌、前列腺癌、肺癌及肝癌等多种肿瘤中均发挥促进肿瘤生长、促使肿瘤侵袭转移的重要作用[4-10]。但是,胃癌中BDNF的表达及作用目前研究尚少。本研究利用免疫组织化学方法检测BDNF在胃癌组织、癌旁正常组织以及转移淋巴结组织中的表达特征,分析其表达水平与胃癌临床病理资料的相关性,并通过受试者工作特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线评估BDNF表达对胃癌诊断的价值,从而探讨BDNF在胃癌发生发展中的作用及临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集2013-01～2016-12在空军军医大学(第四军医大学)唐都医院手术切除的胃癌组织及相应的癌旁正常组织72例,转移淋巴结组织34例。所有组织标本均经病理确诊,切缘未见肿瘤细胞。标本均用4%的多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,制备组织切片备用。72例胃癌患者中,男性50例,女性22例,年龄32-81岁,中位年龄59.3岁。所有患者术前均未接受化疗、放疗或生物治疗等相关治疗措施。

1.1.2 主要试剂 BDNF抗体购自Abcam公司(货号:ab108319),按照1 ∶100比例稀释后作为一抗使用。SP系列工作液试剂盒(货号:SP-9000)以及DAB显色试剂盒(货号:ZLI-9032)均购自北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 组织标本免疫组化染色 免疫组化染色采用SP法按照说明书进行。将包埋好的标本进行5 μm的连续切片,脱蜡水化后加入3%的H2O2,室温下反应;再将切片放置于柠檬酸缓冲液中,微波加热以修复抗原;冷却至室温后加入山羊血清封闭30 min;加入鼠抗人BDNF多克隆抗体(1 ∶300),过夜反应后加入生物素标记的二抗(1 ∶2 000),放置于保湿盒中加入反应液,PBS振洗3次;然后加入DAB试剂后根据观察控制显色时间,用蒸馏水冲洗;苏木精衬染,蒸馏水冲洗后脱水透明,用中性树胶封片。

1.2.2 结果判定 免疫组化结果由两位高年资病理医师独立判定,评分医师对患者的临床以及病理资料均不知情。具体方法如下:每张切片随机选择5个视野,每个视野计数500个细胞。根据染色强度分为:0分为无染色;1分为弱染色;2分为中等强度染色;3分为强染色。根据染色细胞百分比分为:0分为0%;1分为1%-25%;2分为26%-50%;3分为51%-75%;4分为76%-100%,两者之和为最终评分,≤3分为阴性,>3分为阳性。

1.3 统计学分析

采用SPSS20.0统计软件对结果进行分析。采用卡方检验对计量资料进行分析,采用ROC曲线评估BDNF表达在胃癌中的诊断价值,P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BDNF在胃癌、癌旁及转移淋巴结组织中的表达

在癌旁组织、胃癌组织和转移淋巴结组织中BDNF的免疫组化染色逐渐增强(见图1)。结果显示,胃癌组织中BDNF表达阳性率为69.4%,其表达水平显著高于癌旁正常组织(40.2%)(P<0.01),而转移淋巴结组织中BDNF表达水平为三者中最高,其表达阳性率为73.5%,与胃癌(P<0.05)及癌旁正常组织(P<0.01)相比,差异均具有统计学意义(见表1)。

2.2 BDNF在胃癌中的表达及与临床病理特征的关系

72例胃癌组织中BDNF阳性表达50例,统计学分析显示,BDNF的阳性表达与患者肿瘤的分化程度(P<0.05)、TNM分期(P<0.05)、淋巴转移(P<0.01)及远处转移(P<0.05)呈显著相关,而与患者的年龄、性别及肿瘤大小无明显相关性(P>0.05,见表2)。

A.癌旁组织 B.胃癌组织 C.转移淋巴结组织图1 BDNF在癌旁、胃癌及转移淋巴结组织中的表达(免疫组织化学,×400)Figure 1 Expression of BDNF in adjacent non-tumor, primary gastric cancer and metastatic lymph node tissues (×400)

表1BDNF在癌旁、胃癌及转移淋巴结组织中的表达

Table1TheexpressionofBDNFinadjacentnon-tumor,primarygastriccancerandmetastaticlymphnodetissues

组织nBDNF阴性阳性χ2P癌旁组织7243(598)29(402)12367a 0000a胃癌组织7222(306)50(694)4203b0040b转移淋巴结组织349(265)25(735)10218c0001c

a癌旁组织vs胃癌组织;b胃癌组织vs转移淋巴结组织;c癌旁组织vs转移淋巴结组织

表2BDNF在胃癌中的表达及临床病理相关性

Table2RelationshipbetweenexpressionofBDNFandclinicopathologicalfeaturesingastriccancer

临床特征nBDNF阴性阳性χ2P年龄21120146 <60岁271116 ≥60岁451134性别05040478 男501436 女22814分化程度90200011 高分化1174 中分化24915 低分化37631TNM分期46610031 I-II291316 III-IV43934肿瘤大小21140146 <5cm511338 ≥5cm21912淋巴结转移81640004 否281414 是44836远处转移39600047 否642242 是808

2.3 BDNF的表达在诊断胃癌中的价值

绘制ROC曲线评估BDNF在胃癌诊断中的价值,结果显示BDNF表达对胃癌诊断具有一定价值(95%CI 0.645-0.811,P<0.001),曲线下面积(AUC)为0.728(见图2)。

3 讨论

胃癌是消化系统的恶性肿瘤,严重威胁人类的生命健康,虽然经过多年研究,胃癌的发病机制仍并不明确[11,12],而阐明其发生发展机制,对胃癌的诊治至关重要。

图2 BDNF表达鉴别诊断胃癌的ROC曲线Figure 2 ROC curves of the diagnostic value of BDNF expression in gastric cancer

BDNF是神经营养因子家族的重要成员之一,通过与其高亲和力受体酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)或/和低亲和力受体p75神经生长因子受体结合[13],激活下游PI3K/PDK1/Akt、Ras/MAPK、PLCγ等细胞信号转导通路以及上调Ca2+通道等途径[14-16],从而发挥生物学效应。大量研究表明,BDNF不仅在神经元发育、功能维持以及神经元群成形中发挥重要作用[17],还与多种神经系统肿瘤和非神经系统肿瘤的增殖、侵袭转移、血管生成、失巢凋亡等恶性生物学行为密切相关[18-21]。BDNF在肺癌特别是大细胞神经内分泌癌中表达明显升高,并可通过增加MMP-2及MMP-9活性促进肿瘤侵袭转移[22]。另外,BDNF在结肠癌组织及细胞系中呈高表达,与正常组织及细胞系相比差异具有统计学意义,同时高表达BDNF还与肿瘤细胞对胃泌素释放肽受体(gastrin-releasing peptide receptors,GRPR)拮抗剂耐药有关[23]。Guo等[24]发现在肝癌组织中BDNF亦呈高表达,并与肿瘤进展及恶性程度密切相关,同时BDNF还参与维持肿瘤细胞生存,促进细胞侵袭转移等生物学行为。但是,在消化道最为常见的恶性肿瘤之一的胃癌中BDNF的表达及作用目前研究尚少,而明确BDNF在胃癌中的表达特征是进一步深入研究其机制的基础。

本研究中,我们利用免疫组织化学的方法分别检测胃癌、癌旁及转移淋巴结组织中BDNF表达,发现BDNF在胃癌组织表达水平明显上调,显著高于癌旁正常组织,而在转移淋巴结组织内BDNF的表达水平又显著高于胃癌组织,为三者中最高。进一步研究发现,BDNF表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴转移及远处转移呈明显正相关,即肿瘤分化程度越低、TNM分期越高、存在淋巴结转移及远处转移时,BDNF表达越高。这些结果提示我们,BDNF在胃癌的侵袭转移中发挥着重要作用。另外,我们采用ROC曲线评估BDNF表达对胃癌的诊断价值,其AUC为0.728,表明BDNF对于胃癌有一定的诊断价值。

因此,本研究结果提示BDNF在胃癌中可能发挥癌基因功能,并可能为胃癌恶性生物学行为以及胃癌诊断提供新的重要指标,抑制其表达可能减缓甚至阻止胃癌的发生发展,但其具体的分子机制仍有待进一步探讨。

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