家养动物转录组学研究进展

黄永震，张桂民，贺 花，逯倩倩，雷初朝，陈 宏*

(1. 西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西 杨凌 712100；2. 西北农林科技大学动物医学学院，陕西 杨凌 712100)

1 转录组及其研究方法

2003年，人类基因组计划测序工作完成；随后，各种动植物的遗传信息又相继被揭示，伴随着对遗传信息研究的不断深入，许多问题也逐渐出现，需要在基因组、转录组乃至蛋白质组等方面进行更深入的研究。生物的许多功能并不是都是由单一的基因所控制的，有很多性状，尤其是经济性状是由许多基因共同调控的。由此，使得对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究，进入了功能基因组学研究时代(也称为后基因组时代)。功能基因组学，就是利用结构基因组学提供的信息来进行基因功能的研究，主要内容包括：全长cDNA克隆与测序、获得DNA芯片等基因转录图谱、突变数据体库的构建、高通量的遗传转化鉴定系统、生物信息技术平台与相应数据库的构建、研究基因组表达的全部蛋白质及其相互作用为主要内容的蛋白质组学(Proteomlcs)等[1]。由于遗传信息从DNA传递到蛋白质是一个十分复杂的过程，在这一过程中DNA首先转录成为RNA,RNA再经过翻译形成蛋白质，RNA在这个过程中起到承上启下的“桥梁”作用。所以，转录组学是功能基因组学的一个非常重要的研究领域，

所谓的转录组，是指在某一特定的阶段，由细胞转录出的所有RNA，包括有mRNA、rRNA、tRNA和其他一些非编码RNA(包括lncRNA、microRNA等)[2]。转录组是连接基因组遗传信息与功能蛋白质组的纽带，基因表达在转录水平的调控是生物体重要的调控方式之一，主要受到内源或外源因子的影响。因为不同细胞或者同一细胞在不同的时间或空间下所转录的RNA是不完全相同的，所以转录组反映的是某一特定的发育或生理阶段特定的细胞或组织基因的表达情况。

目前，研究转录组的方法有很多种，主要可分为三类：(1)基于杂交的技术，如基因芯片(Gene chip)等；(2)基于测序的技术，如表达序列标签(ExpressedSequence Tag, EST)、基因表达序列分析(Serrial Analysis of Gene Expression, SAGE)等；(3)基于新一代高通量测序技术的转录组测序(RNA sequencing, RNA-Seq)技术。此外，还有生物信息学等诸多数据处理和分析的研究方法。

基因芯片(Gene chip)又称为DNA芯片(DNA chip)，生物芯片(biological chip)，由Stephen Fodor博士于1991年首次提出[3]。基因芯片就是指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取成千上万样品分子的数量和序列信息的技术。在生命科学领域可用于基因测序、基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测等诸多领域。其基本原理是将待测DNA或cDNA用荧光或其它方法标记后，与固定在芯片上的探针列阵进行杂交。由于固定在基因芯片上每个位置的核苷酸信息是已知的，杂交之后对芯片上每一位点的荧光强度进行检测，就可以同过芯片上的信息来得到样品的遗传信息[4]。与传统技术相比基因芯片技术具有高通量、效率高、自动化等优点。但是也存在一些缺陷，如成本太高；芯片上探针合成时有时会有错误核苷酸掺入及混入杂质, 使得降低特异性；另外在检测低拷贝数基因时灵敏性较低等，使其使用范围受到极大的限制。

随着人类基因组计划的发展，由美国科学家Venter等于1991年提出表达序列标签(ExpressedSequence Tag, EST)这一技术[5]，该技术最初是用于寻找人类新基因、绘制人类基因组图谱、识别基因组序列编码区[6]等领域的研究。之后，逐渐在动植物基因组的研究中也广泛运用。众所周知，很多真核生物成熟的mRNA都是由3部分组成的，包括：5’端非翻译区(5’ Untranslated Regions, 5’UTR)、开放阅读框(Open reading, frame, ORF)和3’端非翻译区(3’ Untranslated Regions, 3’UTR),由mRNA反转录而得到的cDNA序列相应地也具有这3部分结构。而对于一个基因而言，其5’UTR和3’UTR是特定的，即cDNA的两端具有一段序列(一般长度为300～500bp)，可以代表一定条件下生物体某组织或细胞的基因表达，即“表达序列标签”，用它可以显示某一特定状态下基因表达的情况[7]。

EST方法的基本过程大致为：(1)RNA的提取；(2)mRNA的富集纯化；(3)将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建cDNA文库(4)大规模随机挑选cDNA克隆,对其5’或3’端进行单向测序[8]。通过EST序列分析可以获得家养动物特定组织或细胞在特定的发育时期的基因表达种类，其数量还可反映基因的表达量，EST的数目越多说明基因表达量也高。通过建立ESTs数据库，然后将ESTs数据库与基因数据库已知序列进行比较,就可以获得大量的关于生物生长发育、遗传变异、衰老死亡等与生命活动相关的生物信息[9]。ESTs直接反映了基因表达的生物信息,可用来研究遗传背景还不太清楚的实验材料，还可以用来分离与鉴定新基因、构建遗传学图谱、基因定位和表达谱的研究、还有可以研究比较基因组学和生物信息学等[10,11]。但是由于EST分析过程复杂，结果也受到cDNA文库构建过程中反转录、酶切效率以及文库的代表性等因素的影响[12]，这些问题还有待进一步的改进。

基因表达序列分析(Serrial analysis of gene expression，SAGE)是由Velculescu等于1995年建立的一种研究基因表达模式的技术，可以在整体水平上对细胞或组织中的已知或未知的转录本同时进行大规模的定量分析[13]。其主要的原理是：(1)一个9～10bp的短核苷酸序列标签就能够包含足够的信息，如10bp的核苷酸序列能够分辨也就是1048576个不同的转录产物；(2)如果能将10bp的标签集中于一个克隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入计算机中进行处理，就能对数以万计的转录物进行分析。SAGE技术具有高通量、高灵敏性等优点，但是也存在一些不足之处，一方面进行基因表达序列分析需要大量的RNA；另一方面SAGE文库构建流程长，技术要求高还有单条序列标签所含有的基因信息少[12]。因此，它也不是进行转录组分析的最好途径。

2 RNA-Seq技术

2.1 RNA-Seq技术原理及其优点

RNA-Seq(RNA sequencing)即RNA测序，又称为转录组测序(Transcriptome Sequencing)，新一代测序技术(next-generation sequencing ，NGS)是一种把全部RNA(包括mRNA、smallRNA、non-codingRNA等)或者其中的一部分用高通量测序技术进行测序分析的技术。主要原理及流程为：(1)获得细胞总RNA；(2)根据实验需要对RNA样品进行处理，如用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA等；(3)对处理好的RNA样品进行片段化处理；(4)将处理后的RNA反转录成cDNA，获得cDNA文库；(5)接着在cDNA片段两端连接接头；(6)用新一代高通量测序技术进行测序，获得转录组的遗传信息。RNA-Seq技术是一种非常有用的搜集遗传信息的工具，同时也是对转录组进行综合分析的好方法，可以用来鉴别、定位以及定量分析转录组信息。因RNA-Seq技术具有诸多优点，其出现以后被广泛运用到转录组的研究之中。

相对于其他几种方法RNA-Seq技术具有以下优势：(1)信号数字化，便于管理分析，可直接测定每个转录本的片段序列，不仅对单核苷酸有很高的分辨率，而且也不存在微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音等问题；(2)灵敏度高，能够检测到表达量很低的稀有转录本，可以用来检测新的转录本；(3)不需要设计特异性探针，因此，即使在不了解物种基因信息的情况下，也可以对其转录组进行分析，并且能够检测未知基因、发现新的转录本。另外还可识别可变剪接、单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)、简单重复序列((Simple sequence repeat, SSRs)、插入缺失((Insertion-deletion Indel)、等位基因差异性表达等[14]。

2.2 RNA-Seq技术测序平台

在20世纪70年代，Sanger等发明了双脱氧测序法，在过去的多年中一直被广泛应用，为揭示动植物遗传信息做了极大的贡献，但是这种方法也存在着价格昂贵、通量小、速度慢、获取信息量小等缺点，使得需要进行大规模测的研究难以开展。为了能够在短时间内进行廉价的大规模测序，许多科研工作者对Sanger测序法做了很多改进，并相继产生了二代以及三代测序法。这些技术都能进行转录组的测序，为转录组的研究提供了有效手段。这些技术主要包括Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术,之后Helicos Biosciences公司又推出了单分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术[15]。这些方法极大地提升了测序效率，但是，不同的测序方法也有着自己各自不同的原理和优缺点，表1列举了近年来发展起来的几种主要测序平台并对其进行了比较分析。

表1 几种测序平台的比较[15]

2.3 文库构建和测序

转录组文库的构建过程，主要包括：(1)总RNA的提取：一般用TRIzol法进行提取，所有过程应当在低温无RNA酶的条件下进行，以防止RNA的降解；(2)RNA的质量鉴定：用分光光度计以及凝胶电泳等方式来检测RNA的质量，在电泳时要用RNA灭火处理过的电泳设备和电泳缓冲液；(3)将RNA反转录形成cDNA：用试剂盒或者其他方法将单链的RNA反转录形成cDNA；(4)全长cDNA的克隆：采用PCR扩增的方法获得大量的cDNA并对其进行连接；(5)通过蓝白斑筛选等方式选出连接好的载体。之后便可送交公司进行测序。

2.4 RNA-Seq测序数据分析

目前，已经发表RNA-Seq数据分析相关研究成果的主要有Wang[16]、Trapnell[17]及van Verk[18]等。对有参考基因组的物种的RNA-Seq测序数据分析主要内容有：(1)测序数据的输出；先对通过高通量测序产生的大量文件进行筛选，保留Reads序列数据和对应的碱基质量得分，然后将其输出保留；(2)原始数据过滤，获得高质量数据；刚开始输出原始的数据比较多且复杂，需要对其进行一定的过滤处理，去掉接头、污染等序列最后保留Clean Reads数据；(3)基因组比对；用比对软件对获得的Clean Reads数据与参考基因及基因组序列进行比对分析；(4)估计基因的表达量或表达水平；由于测序过程对打断的转录本进行了随机选择，因此测序结果得到的基因表达水平受到了基因长度、测序深度以及基因表达高低等的影响所以，需要利用读段数Reads来归一化基因表达水平。现在有很多软件可以对基因表达水平进行估计，如rSeq、DEGseq 软件包和Cufflinks等；(5)差异表达基因的筛选。通过差异倍数法(fold change)结合错误发生率(false discovery rate, FDR)控制法等方法对不同样本间的差异基因进行筛选；(6)基因注释。基于假设“同源等于功能相似”，通过将未知基因序列与公共数据库中的已注释基因进行比对，推测出未知基因的功能[19]。

RNA-Seq在解析转录本的结构和生物学功能方面，如发现可变剪切、融合基因以及非编码转录本等有重大的作用。由于测序产出的短reads数据数量十分巨大，要对这些数据进行分析十分困难，在基因组测序研究方面，随着计算生物学的发展，生物信息学家针对基因组测序产出的短reads开发出了SOAP denovo、ABYSS等分析软件，这些软件可以对基因组测序短reads进行组装。但是转录组测序的结果分析远比基因组复杂，包括了转录本表达水平定量、可变剪切鉴定、链方向特异性测序等，因此基因组组装算法不能够直接用于转录组测序的数据分析。近年来，生物信息学家又开发了一些新的专门用于转录组组装的软件，这些软件主要有基于参考基因组的组装方法和de novo组装方法。 关于有参考基因组的转录组组装的软件有Scripture、Cufflinks等，对于有完整参考基因组的转录组装，其组装一般包括三步：①Tophat等工具将短reads定位到基因组上②根据短reads在基因组位置上的重叠关系，将短reads连接形成cluster片段，进一步构建出所有可能的剪接异构体结构图。③用Scripture或Cufflinks鉴定可变剪接。 (2)de novo组装方法：de novo组装不依赖参考基因组，直接利用 reads 间的重叠信息进行组装。常用的方法有两种，一种是基于overlap的组装，另一种用De Bruijn结构图进行组装。而后者更适用于数据产量较大的真核转录组的组装，组装软件有Trans ABy SS、Trinity等。由于目前大多数物种仍没有参考基因组，因此de novo组装方法也有着更广泛的应用范围。这种方法也避免了一条reads比对到多个位置、内含子过长等组装难题。但这种方法的缺陷也是非常明显的，对计算性能和测序深度都要求较高，也容易丢失低丰度的转录本[20]。

2.5 RNA-Seq技术的应用

RNA-Seq技术可用于多方面的研究，主要包括：(1)基因表达水平研究，RNA-Seq技术是定量的，使得它可以很准确地确定RNA的表达水平。从原则上来看，它甚至可以确定一个细胞群中的每一个分子的绝对数量，得到的实验结果可以进行直接比较；(2)发现低丰度的全新转录本，RNA-Seq不像基于杂交的芯片等技术具有很大的不确定性，它不收背景噪音的干扰，具有更高的灵敏性，许多实验证明RNA-Seq技术能比芯片技术检测出更多的转录本；(3)转录本结构研究，通过测序结果与基因组序列对比就可对可变剪接等作出判断；另外还可以做转录本结构变异研究、非编码区域功能研究、基因表达水平研究、长链非编码功能研究、转录本结构研究等。

3 家养动物转录组学研究进展

3.1 牛

RNA-Seq技术在牛上应用十分广泛，Driver AM et al.[21]用RNA-Seq技术以体内和体外培养的牛囊胚为试验材料，探索了影响牛体外受精率的主要候选基因和信号通路,通过分别对体外26906451和体内38184547条片段进行测序，发现有17634个基因发生表达，其中793个基因在两种组织中有显著的差异表达，并且发现了395个新的转录本，有4800个基因发生了可变剪接，有873个基因发生了不同的可变剪接。Wickramasinghe[22]对不同泌乳阶段一泌乳15 d、90 d和250 d奶样中体细胞利用RNA-Seq技术进行差异表达基因分析，结果显示在泌乳15 d、90 d和250 d的体细胞中分别有16892、19094和18070个基因进行表达，其中有大约9000个基因是在整个泌乳期都进行表达的；Huang et al[23]利用Solexa sequencing 和生物信息学工具通过对荷斯坦奶牛的睾丸和卵巢组织的miRNA组织进行研究，分别在睾丸和卵巢组织中检测到100和104个新的pre-miRNAs，他们各自编码122、136个成熟的miRNAs，并且其中的6个miRNAs为牛所特有。有246个已知的miRNs在两种组织中共同表达。贺花[19]通过分析秦川牛成年牛和胎牛肌肉组织的差异表达谱，发现成年牛中有5304个基因上调表达，10870个基因下调表达，其中有1893个基因表达量显著上调，4904个显著下调。

Lan D L等[24]用RNA-Seq技术对牦牛卵巢组织进行高通量测序分析，得到一个包含 26826516条过滤后测序读数, 4828772880 bp 的卵巢测序文库， 随后将测序序列用SOAPaligner/SOAP2 软件与基因组比对，结果发现有16992条基因发生表达，其中有3734条存在有不同类型的可变剪接。对转录组数据的进一步分析发现共有7340个基因的 5′或 3′端在原有基因组的位置基础上发生了延伸，并且有6321个词的转录本被发现，与基因组序列比对定位发现外显子数有1～84个,新发现的转录本中预测有2267个具有编码蛋白的能力。另外Finucane KA et al.[25]利用Affymetrix芯片技术对干奶期和泌乳期牛乳腺组织进行了差异基因表达研究。在其他方面关于转录组测序的研究还包括一些对牛肝、脑垂体以及副结核病的研究。

3.2 山羊和绵羊

孟宪然等[26]利用RNA-Seq技术对4个绒山羊背最长肌的转录组进行高通量测序，然后通过CLC Genmics Workbench6.0等软件进行基因筛选，共找到263个候选基因，分别为123个高表达有利基因和140个高表达有害基因。然后进一步用GO功能注释进行分析，结果显示，高表达有利基因主要与骨骼肌的生长发育、细胞器的形成和蛋白结合功能有关；高表达有害基因主要与脂质代谢、细胞骨架以及结合功能有关。利用KEGG数据库作为参考，发现这些基因主要参与的通路有糖酵解或糖异生、丝裂原活化蛋白激酶、凝血-补体级联反应和色氨酸代谢等。Dong等[27]通过对云南黑山羊的基因组和转录组分析获得22175个编码蛋白的基因，分析比较初级毛囊和次级毛囊的转录组获得了51个差异表达基因，为进一步研究重要的经济性状的候选基因奠定了基础。Fan等[28]以苏尼特羊的不同被毛颜色特征为研究点，分别从白皮和黑皮绵羊中得到90006和74533个组装序列，并且发现编码核糖体蛋白和角蛋白相关的蛋白质的基因被最高度表达，总共有2235个已知基因在黑与白绵羊皮的差异表达，包括有479个上调基因和1756个下调基因等。Geng等[29]用RNA-Seq技术分析克什米尔细毛山羊毛囊生长期、生长中期、和静止期三个发育阶段分别生成的8487344、8142514和7345335条clean reads，共发现有1332个基因表达差异显著。其中683个基因在囊生长期和生长中期表达差异显著，530 个DEGs生长期和静止期中被鉴定出来。在差异表达的基因中大多数与毛囊发育不同阶段生物调节和代谢过程有关。

3.3 猪

冉茂良等[30]运用Illumina Hiseq 2500 测序平台对60胚龄、90胚龄、30日龄和180日龄4个发育时期的猪的睾丸组织进行转录组测序，获得转录组数据后与猪基因组数据比对，对猪基因组的可变性剪接事件进行了鉴定和分析。结果从猪的基因组中鉴定出20398 个基因发生了92738 种不同的可变剪接。并且发现在不同的可变剪接类型中, 以第一个外显子可变剪切(Alternative 5′first exon, TSS)、最后一个外显子可变剪切(Alternative 3′ last exon, TTS)、单外显子跳跃(Skipped exon, SKIP)和可变5′或3′端剪切(Alternative exon ends, AE) 4种类型为主。随后进行GO功能富集分析，结果显示发生可变剪接的基因主要富集于物质合成、物质结合及酶活性相关的GO项中，而各发育时期特异的可变剪接基因与发育时期的生理状态密切相关，60胚龄时主要与酶活性和组织形成相关，30日龄时主要与抗环境应激和离子通道活性相关, 180日龄时则主要与循环系统相关。此外，在筛选出的与睾丸素代谢相关的基因64个中, 63 个基因发生可变剪接，且以TSS和TTS为主，表明这两种可变剪接类型与睾丸素合成和分泌密切相关。通过对猪基因组可变剪接的分析，为深入研究可变剪接生物学功能及进一步开展分子育种工作提供理论依据。

莫德林等对不同时期瘦肉型长白猪和脂肪型蓝塘猪的背最长肌进行RNA-Seq，通过对测序数据的分析发现不同的发育时期有595个基因表达差异显著；Samborski et al.利用RNA-Seq技术对未怀孕和开始着床的猪的子宫内膜进行对比分析，发现1993个差异表达基因[31]。

钟邦胜[32]对荣昌猪和亚洲野猪转录组进行研究发现，在脂肪组织中，两个物种具有17084个共有的转录本，特有的分别有878和649个，具有差异转录本有1235个；同样的，在肌肉组织中，荣昌猪和亚洲野猪共有的转录本有16187个，特有的转录本分别有718个和750个，差异转录本有361个。本研究的结果表明荣昌猪和亚洲野猪的转录本的总体差异，侧面反映了家猪和野猪的差异。

3.4 鸡

转录组研究在鸡上的报道相对较少。鸡的采食量是营养上面的一个非常重要的指标，对于鸡的产蛋量以及日增重有着很重要的影响。易国强[33]利用了RNA-Seq技术对鸡剩余采食量性状在转录组水平上进行了差异表达分析，发现了41个与剩余采食量有关的差异表达基因，发现这些基因主要涉及到消化吸收，代谢能力，氧化应激和机体能量稳态等过程。弥补了目前研究的不足。同时，究鉴定了253个基因间具有编码功能的新转录本，有利于改善鸡基因组中未注释基因的结构和功能，有助于优化现有的基因模型。

不同的环境也会给动物的生长发育带来不同的影响。施寿荣[34]通过选择肉鸡分为不同的两组-对照组和低温诱导组，RNA-Seq分析结果显示两组鸡在21日龄时有287个基因表达差异显著，包括90个上调基因和197个下调基因；35日龄有390个基因发生了差异表达，上调和下调基因分别有212和178个，主要参与了只代谢、细胞分化等信号通路。Hick[35]等通过高通量测序技术对11日龄的鸡胚进行研究，发现了4个新的microRNA。

4 问题与展望

随着高通量测序技术的发展，以基因组学为代表的生命科学得到了前所未有的繁荣和飞速发展。转录组学研究也有了很大的进展，RNA-Seq技术以其高通量、高灵敏度、数字化信号等优点被广泛运用到各个领域的研究中，RNA-Seq技术在动物转录组学方面的研究，已经取得了丰硕的成果，发现了在基因组研究中没有发现以及没有解决的很多问题，尤其是在可变剪接以及发现低丰度的全新转录本方面具有十分强大的作用。RNA-Seq技术除了在家养动物中广泛应用外，也逐渐在其他物种中开始运用，这项技术对于遗传背景相对薄弱的物种研究具有更大的意义。相对于一代测序技术有了很大的发展，但是任何技术都尤其自身的缺陷，RNA-Seq技术也存在一定的局限性：(1)测序成本太高；相对于传统的Sanger测序法，二代测序成本大大下降，但是要进行大规模的测序所需要的费用依然很庞大；(2)测序结果中存在有有错配等问题，使得开发出来的SNP、SSR和可变剪切的假阳性率较高，还有待进一步改进；(3)测序长度、时间等方面还有待进一步提升，读长越长，拼接形成一个基因所需要的reads更少，因而错误率越低。而且读长越长意味着一次测序可以测定更多的基因。另外，因RNA-Seq技术获得的信息量十分巨大，对其进行分析十分重要，所以与其相关的计算机科学以及生物信息学也要为转录组数据分析提供强大的分析工具。综上所述，虽然目前RNA-Seq技术还存在一些问题，但随着科学技术的发展，相信它将会成为研究转录组学的重要工具，能够发现更多、更可靠的新转录本。

参考文献:

[1] 陶彦彬,蒋建雄,易自力,李骏智. 功能基因组学及其研究方法[J]. 生物技术通报,2007,05:61-64.

[2] Costa V, Angelini C, De F I, et al. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J Biomed Biotechnol, 2010 (2010): 853916.

[3] Fodor S P A ,Read J L , Pirrun GM C. Light directed, spatially addressable parallel chemical synthesis[J]. Sience, 1991, 251: 767-773.

[4] 熊伟. 基因芯片技术在生命科学研究中的应用进展及前景分析[J]. 生命科学仪器,2010,02:32-36.

[5] Adams M D, Kelley J M, Gocayne J D, et al. Comple-mentary DNA sequencing: expressed sequence tags andhuman genome project [J]. Science, 1991, 252 (5013):1651-1656.

[6] Boguski M S. The turning point in genome research [J].Trends Biochem Sci, 1995, 20(8): 250-296.

[7] 吴春颖,宋经元,陈士林. 表达序列标签在药用植物研究中的应用[J]. 中草药,2008,05:778-782.

[8] 王晓娜,卢欣石. 表达序列标签的应用现状及分析方法研究[J]. 草业科学,2010,05:76-84.

[9] 吴春颖,宋经元,陈士林. 表达序列标签在药用植物研究中的应用[J]. 中草药,2008,05:778-782.

[10] Collins F S, Patrinos A, Jordan E, et al. New goals for theU. S. human genome project: 1998-2003 [J]. Science,1998, 282(5389): 682-690.

[11] Hattori M, Tsukahara F, Furuhata Y, et al. Anovel methodfor making nested deletions and its application for sequencingof a 300 kb region of human APP locus [J]. Nucleic AcidsRes, 1997, 25(9): 1802-1808.

[12] 吴琼,孙超,陈士林,罗红梅,李滢,孙永珍,牛云云. 转录组学在药用植物研究中的应用[J]. 世界科学技术(中医药现代化),2010,03:457-462.

[13] VelculescuVE,ZhangL,VogelsteinB,etal.serialanalysisofgeneexpression[J].Science,1995,270:484～487.

[14] 李江域,陈胜,王小磊,赵东升,王玉民. RNA-Seq本地分析平台的构建[J]. 生物技术通讯,2015,02:211-214.

[15] 祁云霞,刘永斌,荣威恒. 转录组研究新技术:RNA-Seq及其应用[J]. 遗传,2011,11:1191-1202.

[16] Wang E T, Sandberg R, Luo Shujun, et al. Alternative iso?form regulation in human tissue transcriptomes[J]. Nature,2008,456(27):470-476.

[17] Trapnell C, Roberts A, Goff L, et al. Differential gene andtranscript expression analysis of RNA- Seq experiments withTop Hat and Cufflinks[J]. Nat Protocols, 2012,7(3):562-578.

[18] van Verk M C, Hickman R, Pieterse C M J, et al. RNA-Seq: revelation of the messengers[J]. Curr Opin Chem Biol,2013,17:4-11.

[19] 贺花. 秦川牛肌肉生长发育相关基因和蛋白质的筛选及其初步鉴定[D].西北农林科技大学,2014.

[20] 凡文磊. 利用RNA-seq技术挖掘鸡肠炎沙门氏菌抗性相关功能基因[D].中国农业科学院,2015.

[21] Driver AM, Penagaricano F, Huang W et al. RNA-Seq analysis uncovers transcriptomic variations between morphologically similar in vivo-and in vitro-derived bovine blastocysts. BMC Genomics. 2012.13:118.

[22] Wickramasinghe S,RinconG, Islas-Trejo A et al.Transcriptionalprofiling of bovine milk using RNA sequencing.BMC Genomics.2012.13:45.

[23] Huang J, Ju Z,Li Q et al.Solexa sequencing of novel and sifferentially expressed microRNAs in testicular and ovarian tissues in Holstein cattle.Int J Biol Sci.2011.7(7):1016-26.

[24] Lan D L, Xiong X R, Wei Y L, et al. RNA-Seq analysis of yak ovary: improving yak gene structure information and mining reproduction-related genes. Sci China Life Sci, 2014, 57, in press.

[25] Finucane KA,McFadden TB,Bond JP et al. Onset of lactation in the mammary gland: gene expression profiling indicates a strong inhibition of gene expression in cell proliferation. Funct Integer Genomics.2008.8(3):251-64.

[26] 孟宪然,杜琛,王静,付绍印,郑竹清,张文广,李金泉. 基于RNA-Seq识别山羊肉品质候选基因[J]. 畜牧兽医学报,2015,08:1300-1307.

[27] Dong J, Xie M, Jiang Y, et al. Sequencing and automa-ted whole-genome optical mapping of the enome of adomestic goat (Capra hircus) [J]. Nature Biotech-nology,2013,31(2):135-141.

[28] Fan R, Xie J, Bai J, et al. Skin transcriptom profiles associated with coat color in sheep[J]. BMC Genom-ics, 2013,14(1):389.

[29] Geng R,Yuan C, Chen Y. Exploring differentially ex-pressed genes by RNA-Seq in cashmere goat (Capra hircus) skin during hair follicle development and cycling[J]. PLoS One,2013,8(4):e62704.

[30] 冉茂良,陈斌,李智,董莲花,贺长青,柳小春. 基于RNA-seq测序数据鉴定和分析猪基因组可变剪接事件[J]. 中国科学:生命科学,2016,03:274-284.

[31] 崔晓钢. 基于RNA-seq与small RNA-seq进行奶牛产奶性状功能基因挖掘及生物信息学预测牛新miRNA[D].中国农业大学,2015.

[32] 钟邦胜. 野猪和家猪脂肪和肌肉组织的比较转录组研究[D].四川农业大学,2015.

[33] 易国强. 利用二代测序挖掘鸡拷贝数变异及影响饲料效率的候选基因[D].中国农业大学,2015.

[34] 施寿荣. 肉鸡腹水综合征的代谢组学和转录组学研究[D].中国农业大学,2014.

[35] Hicks J A，Tembhurne P，Liu H C．MicroRNA expression in chicken embryos[J]．Poult Sci，2008，87(11)：2335-2343.