皖南牛Y-STRs与Y-SNPs遗传多样性研究

侯佳雯，夏小婷，贾玉堂，刘善斋，党瑞华，陈 宏，雷初朝*

(1.西北农林科技大学动物科技系统，陕西 杨凌 712100；2.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽 合肥 230031；3.国家肉牛牦牛产业技术体系亳州综合试验站，安徽 亳州 236800)

皖南牛主要产于安徽省长江以南的泾县、黟县、歙县、绩溪、旌德，在皖浙、皖赣交界山区亦有分布。主产区地势较高，地形错综复杂，大致可分为高山和中山区(海拔500 m以上)、低山丘陵区(海拔250 m左右)和盆谷区，当地自然条件好、气候温暖、草场广、牧地多，是发展草食性家畜的天然基地[1]。皖南牛为役肉兼用品种，具有耐耙、耐粗饲、耐热等特性，肉质细嫩、味道鲜美，是我国优良的地方黄牛品种之一[2]。目前，有关皖南牛Y染色体遗传多样性、种群遗传结构及遗传背景的研究未见报道。

Y染色体遵循父系遗传，单倍型保持完整，不易受重组和回复突变影响，突变率低、稳定遗传，是研究物种进化和遗传多样性的良好标记。近年来，基于家牛Y染色体单核苷酸多态性标记(Y-SNPs)的研究表明[3-5]，家牛由3种Y染色体单倍型组组成(即普通牛Y1和Y2单倍型组，瘤牛Y3单倍型组)。在Y-STRs标记多态性研究方面，发现欧亚牛、非洲牛和欧洲牛父系存在不同的单倍型组[4,6]；Cai等[7]通过对中国地方黄牛品种进行Y-STRs多态性研究，发现2个Y-STRs位点具有明显的多态性，可以区分普通牛和瘤牛血统。Li等[8]利用4个Y-SNPs标记和2个Y-STRs标记对16个中国黄牛品种进行多态性分析，表明中国黄牛主要存在普通牛Y2和瘤牛Y3两个父系起源，且各品种的Y染色体单倍型组呈现出清晰的地理分布规律。

因此，本研究利用2个Y-SNPs标记和2个Y-STRs标记联合分析皖南牛的父系起源、遗传多样性和群体遗传结构，旨在为今后开展皖南牛的保种与选育工作提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 样品采集及基因组DNA提取

从安徽省皖南牛保种场采集35头皖南牛公牛耳组织，放在75%酒精中带回实验室保存，采用常规的酚-氯仿抽提法提取基因组DNA，稀释浓度至10～20 ng/μL保存备用。

1.2 引物合成和PCR扩增

选用Götherström等[3]和Ginja等[4]报道的2个家牛Y-SNPs标记(即UTY-19和ZFY-10)引物信息和家牛2个经典的Y-STRs位点，即INRA189和BM861标记，参照Edwards等[6]报道的位点信息研究皖南牛的父系起源，引物信息详见表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 家牛Y-SNPs与Y-STRs标记的信息

PCR体系(25 μL)为：2×PrimeSTAR Max Premix(上海宝生物公司)10.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，超纯水12.5 μL。

PCR反应程序为：98℃变性10 s，X℃(见表1)退火15 s，72℃延伸10 s，35个循环，后冷却至4℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶(含GoldView核酸染料)电泳后，凝胶成像系统拍照检测。

1.3 测序、单倍型组分型及单倍型多样度分析

将PCR纯化产物送生工生物工程(上海)股份有限公司，用3730XL型DNA测序仪(Applied Biosystems公司)进行正、反向测序，测序结果用Chromas2.3软件进行核实查看和校正，获得每头皖南牛公牛2个Y-SNPs标记的序列多态性。利用荧光标记2个Y-STR位点INRA189和BM861，进行毛细管电泳分析，根据Götherström等[3]和Li等[8]报道的Y染色体微卫星分型，确定不同个体的单倍型，用Arlequin3.5软件进行群体单倍型多样度分析。

2 结果与分析

通过对35头皖南牛2个Y-SNPs标记(即UTY-19和ZFY-10)PCR扩增产物进行测序，发现UTY-19标记存在C>A颠换，而ZFY-10标记存在C>T颠换和1个GT核苷酸插入/缺失多态位点。对照Götherström等[3]和Ginja等[4]报道的家牛Y染色体单倍型组的判定标准，并依据2个标记的核苷酸变异确定单倍型组，结果显示：35头皖南牛有Y1、Y2和Y3 3种单倍型组，Y2和Y3单倍型组的频率分别为8.56%(3/35)和88.58% (31/35)，其中只有1个个体为Y1单倍型组，频率为2.86%，表明皖南牛以Y3单倍型为主。皖南牛的Y染色体单倍型多样度为0.2185±0.0924。

利用2个家牛Y染色体特异性微卫星标记(即INRA189和BM861)分析皖南牛的遗传多样性，结果显示，INRA189标记在皖南牛中检测到5个等位基因，其中1个等位基因(98 bp)对应Y1单倍型组，3个等位基因(102 bp、104 bp和106 bp)对应Y2单倍型组，1个等位基因(88 bp)对应Y3单倍型组。在BM861位点中，皖南牛的等位基因大小为158 bp和156 bp，分别对应普通牛和瘤牛单倍型组。

结合Y-SNPs和Y-STRs标记联合分析，在35头皖南牛中共界定了5种单倍型，包括1个Y1单倍型(Y1-98-158)、3个Y2单倍型(Y2-102-158、Y2-104-158和Y2-106-158)和1个Y3单倍型(Y3-88-156)(表2)，其中Y3-88-156单倍型占绝对优势(88.57%)。

表2 皖南牛Y染色体单倍型频率

3 讨论

近年来，Y-SNPs和Y-STRs被广泛应用于群体遗传多样性、群体遗传结构和父系起源研究[3-9]。Götherström等[3]和Ginja等[4]研究表明，欧洲牛为普通牛起源，其中Y1单倍型组主要分布在北欧，Y2单倍型组主要分布在南欧。Edwards等[6]在此基础上通过分析138个欧洲和亚洲品种，进一步说明欧洲牛只存在普通牛血统，亚洲西南部主要为瘤牛起源。

皖南牛是安徽省优良的地方品种，系南方黄牛类型。目前，关于皖南牛这一地方品种在分子水平上的遗传多样性、群体遗传结构和父系起源的报道甚少。常振华等[9]利用两个Y-STRs位点对11个皖南牛个体进行分析，发现皖南牛全部为瘤牛血统；Li等[8]利用Y-SNPs和Y-STRs联合分析，结果同样支持皖南牛为瘤牛父系起源。本研究通过对35头皖南牛公牛进行Y-SNPs分析，检测到皖南牛以瘤牛Y3单倍型组(88.57%)为主，并有少量普通牛Y1单倍型组(2.86%)和Y2单倍型组(8.57%)。该结果与Li等[8]提出的Y3单倍型组主导南方黄牛观点一致，这可能与地理隔离和气候状况相关。35头皖南牛中发现1个个体为Y1单倍型组，这1个个体很可能是由于引入中国的欧美肉牛品种改良皖南牛品种，由雄性介导的基因渗入所致[9]。赵晓诚等[10]利用Y-SNPs标记对陕西岭南牛的分析，发现岭南牛属于南方黄牛类型，仅有普通牛Y2和瘤牛Y3 起源，没有Y1起源，表明Y1单倍型组在中国地方黄牛中确实占的比例很低，支持Y1单倍型组来源于国外引入品种的观点。

Y染色体微卫星位点INRA189和BM861是区别普通牛和瘤牛的经典标记。Edwards等[6]发现INRA189位点的大小在90～106 bp之间，BM861的位点大小为156 bp和158 bp。本研究结果显示，INRA189鉴定出5种不同大小的等位基因，分别为98 bp、102 bp、104 bp、106 bp和88 bp；BM861鉴定出2种等位基因，即156 bp和158 bp。该结果与Edwards等[6]的一致，说明INRA189和BM861两个微卫星位点能清晰地区分出皖南牛中的普通牛和瘤牛血统。

单倍型多样度是衡量群体DNA遗传多样性的重要指标之一。Edwards等[6]对138个家牛品种的Y染色体遗传多样性进行分析，结果显示单倍型多样度平均值为0.4220。Li等[8]对16个中国地方黄牛品种的父系遗传多样性分析，表明其单倍型多样度平均值为0.5180，其中南方黄牛的单倍型多样度平均值为0.3120。在本研究中，35头皖南牛的单倍型多样度为0.2185，低于Edwards等[6]检测的国外牛品种的单倍型多样度平均值，同时也低于Li等[8]报道的中国南方黄牛平均值，表明皖南牛Y染色体单倍型多样度较低，这可能与皖南牛以本交为主，现多处于农户自繁自养状态相关[1]。另一方面，也说明皖南黄牛父系种质资源比较纯正，遗传稳定。

皖南牛是中国优良的地方牛种之一。近年来，皖南黄牛养殖量大幅下降可能是杂交牛肉低价格冲击、散养户养殖越来越少[2]的原因所致。此外，外来品种杂交导致皖南牛的基因构成产生变化，加之人们对种质资源保护意识淡薄，导致皖南牛养殖数量急剧下降。因此，应当加大皖南牛保种开发力度，建立健全皖南牛的保种体系，使得这一优质的种质资源得以保护和开发利用。

参考文献:

[1] 国家畜禽遗传资源委员会. 中国畜禽遗传资源志:牛志 [M].中国农业出版社, 2011：77-79.

[2] 胡嘉彦. 安徽省绩溪县皖南黄牛的品种简介和保种思路[J]. 畜牧与饲料科学, 2017, 38(5):42-44.

[3] Götherström A, Anderung C, Hellborg L, et al. Cattle domestication in the Near East was followed by hybridization with aurochs bulls in Europe[J].Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences,2005,272(1579):2345-2351.

[4] Ginja C, Telo da Gama L. Penedo MCT. Y Chromosome haplotype analysis in Portuguese cattle breeds using SNPs and STRs[J].Journal of Heredity,2009,100(2):148-157.

[5] 常振华, 卫利选, 张润锋,等. 中国黄牛Y-SNPs遗传多样性与起源研究[J].畜牧兽医学报, 2011, 42(11):1537-1542.

[6] Edwards CJ, Ginja C, Kantanen J, et al. Dual origins of dairy cattle farming-Evidence from acomprehensive survey of Europea Y-chromosomal variation [J].PLoS One, 2011, 6: el5922.

[7] Cai X, Chen H, Wang S, et al. Polymorphisms of two Y chromosome microsatellites in Chinese cattle[J].Genetics Selection Evolution, 2006, 38(5)：525-534．

[8] Li R, Zhang XM, Campana MG, et al. Paternal origins of Chinese cattle[J].Animal Genetics,2013,44(4):446-449.

[9] 常振华，黄洁萍，徐苹，等. 中国黄牛Y-STRs遗传多样性与起源研究[J].中国牛业科学,2012, 38(3):9-13.

[10] 赵晓诚，林清，左自意，等. 岭南黄牛Y-SNP遗传多样性与父系起源研究[J].中国牛业科学,2017,43(4):4-6.