对鸡的原生殖细胞冻存后重建种群的研究*

伍佰鑫 ，文平，谢农村，燕海峰 ** （编译）

（1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙 410131；2.湖南佳牛牧业科技有限公司，湖南 长沙 410000)

在家禽面临意想不到的疾病（例如禽流感）大流行时，（冷冻）保存现有种群的遗传多样性，并在未来通过回交重新建立种群，是家禽业生物安全保障、预防禽种（特别是珍稀品种）遗传资源减少或流失的关键措施。目前对鸡卵母细胞或早期胚胎冷冻保存的难题仍未解决；公鸡精子可通过精液冷冻保存，但纯靠精液冷冻保存不能保存鸡的全部基因，因为母鸡是携带W性染色体的配偶；另一种方法是冷冻保存性腺组织，通过器官移植到寄主鸡体，生产出功能正常的精液和卵母细胞。但是，携带供体睾丸组织的公鸡寄主，与携带供体卵巢组织的母鸡寄主交配，仍不能生产出纯种供体鸡的后代。

鸡的原始生殖细胞 （PGCs，早期生殖细胞前体）在鸡的发育期间很早就形成，这些细胞可以从胚胎循环系统中分离出来，再引入寄主鸡胚胎的循环系统中，“殖民化”寄主的性腺，同一性别的寄主鸡（后代）可生产出切实可行的供体鸡精子和卵子。分离出少量的PGCs，通过体外培养增加其数量后再冷冻保存，比直接分离出足够多的PGCs后再冷冻要容易一些 （因为PGCs分离技术难度较大）。英国对鸡的原生殖细胞冻存并重建种群的研究，对于中国禽类遗传资源保存具有较大的参考价值。

1 研究方法[1]

1.1 总体概述 从单个供体鸡胚胎分离出血液，体外培养PGCs至10万个以上、多等分冷冻。一段时间之后，解冻1小瓶PGCs，培养几天以便PGCs苏醒。将PGCs注入寄主鸡胚胎，孵化至出雏，性别鉴定，含有注射的供体鸡PGCs的、同性别的小鸡（后1代）饲养至性成熟，公母鸡交配测试（产蛋孵化，）有些后（2）代鸡就会携带供体鸡的遗传基因（图 1，小鸡 B）。

图1 通过冷冻保存的供体鸡原始生殖细胞（PGCs）重建供体鸡后代

1.2 操作步骤 在国家禽类研究所有5个近交度高的白来航鸡品系，这些鸡是通过回交筛选出主要组织学复合物（MHC）单倍型的品系，它们对许多禽类病毒和细菌病原体的易感性各不相同。6型近交品系对马立克病毒的敏感性不同，O型近交品系缺乏内源性禽白血病病毒，N型和P型近交品系对MD（肌肉萎缩症）的抗性不同，还有W型威康（Wellcome）近交品系，总共 5个品系（6、O、N、P、W）。这些鸡作为几个国家的育种鸡群维持了几十年，已用于疫苗开发和几种病原体的抗病性基因鉴定。虽然与远交品系的遗传基因相比减少较多，但这些近交品系（受精率低，25%～75%）仍然包含某些遗传变异。从这5个品系创建PGCs冷冻库，每个品系15～32个个体，每个性别的品系至少5个个体。

PGC培养基配方：1×B-27补充物、2.0mM GlutaMax培养基（含有L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺稳定形式的二肽，可防止长期培养过程中谷氨酰胺的降解和氨的积累）、1×NEAA（细胞培养添加物，含有7种非必需氨基酸；降低细胞培养时细胞自身生产非必需氨基酸的副作用）、0.1 mM β-巯基乙醇、1×核苷、1.2mM 丙酮酸盐 （或酯）、0.2%卵清蛋白（∑或 σ）、0.2%肝素钠（∑或σ）5μg/ml添加到禽类DMEM（杜尔伯科必需培养基）、一种定制的基础液或改进的DMEM（250 mosmol/L、12.0mM葡萄糖、无氯化钙）。使用之前再添加25ng/ml人用活化素A、4ng/ml人用成纤维细胞生长因子2(FGF2)和0.2%鸡血清。

PGCs采集、培养和冻存：从发育至阶段15～16（孵化2.5d）的鸡胚分离血液，取1.0μl血液置于48孔培养皿（内有300μl培养基）；每隔2d更换三分之一的培养基；当细胞总数达到1.0×105时，每隔 2d更换整个培养基；细胞按（2～4×105个/ml培养基）的速度增殖；将细胞转移至含有4%DMSO（二甲基亚砜）和5%鸡血清的禽类DMEM中，冷冻并-150°C保存。供体鸡胚胎的分离及性别鉴定按Macdonald 等（2010）报道的方法[2]操作。

生殖系传递效率检测：6型品系中公鸡系和母鸡系的细胞在FA（叶酸）细胞培养基中增殖，冷冻保存1星期；解冻细胞；培养几周的时间并计数。鸡蛋孵化2.5d（Hamburger和Hamilton划分的鸡胚发育阶段16）、锐端开窗、5000～6000个公鸡系或母鸡系的细胞注射到背侧主动脉、用帕拉胶膜（石蜡封口膜）密封窗口、锐端向下继续孵化至出雏。雏鸡饲养至性成熟，从成年嵌合体鸡精液中提取基因组DNA，先在多聚酶链反应 (PCR)中筛选，再用镭221引物鉴定精液中190bp等位基因。一只寄主公鸡与野生型母鸡交配，（后1代）野生型公鸡采精，输入寄主母鸡；（后2代鸡蛋）孵化期间采集尿囊膜和血液样本。用QIAamp DNA套件（Qiagen，德国）准备基因组 DNA，通过微卫星分析，鉴定源于供体鸡PGC的后代。

微卫星分析：运用以下引物的源生物科学进行分析：

镭221——CCTTTATCCACTCTTCATGCAC；TGCATAAATTCCATGGGTAAGC。

镭258——CACGCAGCAGAACTTGGTAAGG；AGCTGTGCTCAGTCCTCAGTGC。

MCW145——ACTTTATTCTCCAAATTTGGCT；AAACACAATGGCAACGGAAC。

运用ABI棱镜3730遗传分析仪分析多聚酶链反应(PCR)物。

2 研究结果[1]

2.1 供体鸡品系公母PGC冷冻保存 受精蛋孵化 2.5d（阶段 16），从（鸡胚）背主动脉吸出 1μl血液，转移至培养皿培养2～3周龄；在此期间，血液细胞溶解，PGCs以单个分散细胞的形式存在于培养孔中（图2）。在3周末，给包含10万个以上细胞的培养皿打分，作为源于供体鸡品系的阳性细胞，这些细胞另外培养1周，使其增殖（每0.5ml培养基10万个细胞）；按每瓶50万～10万个细胞的等份进行冷冻和保存。

图2 供体鸡品系单个胚胎培养的PGCs

从表1可知，从单个胚胎开始的培养皿数有203个，该数字是大约630个蛋孵化的结果。这个33%的启动率是因为孵化中的无精蛋；鸡蛋运输和储存过程中损失了受精蛋；近交系鸡胚发育异常；品系间胚胎发育阶段的差异（小于阶段15或超过阶段17）不便采集血液样本。203个培养皿中，有133个培养皿中的PGCs用于冷冻 （共478小瓶=222+256），供体鸡基因传递率66.8%（5个总计数%相加再除以5），源于供体鸡公鸡的基因传递率 （69.6%）与源于供体鸡母鸡的基因传递率（65.4%）类似，表明供体鸡公鸡和母鸡的基因都能传递。根据FAO（1998）维持一个种群最少需要公母各13个基因，本次试验中的6型品系公母鸡都有27个基因、N系有 29个、O系有 30个、P系有32个、W系有15个（需要进一步培养，再生出一个远交种群）。冷冻供体鸡品系公母的单基因型PGC见表1。

表1 冷冻供体鸡品系公母的单基因型PGC

2.2 远系繁殖传送供体鸡品系的PGCs解冻源于供体鸡6型品系公鸡和母鸡的PGC(原始生殖细胞)，培养几周的时间使其增殖；5000～6000个公鸡或母鸡PGC注射入寄主伊莎褐鸡胚胎 （阶段16）的背侧主动脉；这些胚胎孵化至出雏，雏鸡通过PCR(多聚酶链反应)进行性别鉴定；与供体鸡PGC性别匹配正确的寄主鸡雏鸡饲养至性成熟（成为后1代公鸡和母鸡）；（后1代公鸡采精给后1代母鸡输精、种蛋孵化、产生后2代雏鸡）获得了携带6型品系供体鸡PGC的3只公鸡和3只母鸡。用微卫星试探性分析公鸡的精液，鉴定出精液中供体PGCs贡献最大的公鸡。1公2母（后2代携带6型品系供体鸡PGC）与野生型伊莎褐鸡（母公）交配，（后3代）数据显示繁殖率正常，见表2。

表2 新建种群鸡（含有外源PGCs）的繁殖率

运用微卫星分析鉴定这些（后3代）鸡的基因型是否来自6型品系，源生物科学的引物MCW 145产生190bp等位基因的PCR反应物（6型品系基因组DNA），镭258产生265bp等位基因，镭221要么产生207/208bp要么产生235bp等位基因（在这个位点上有两个不同的等位基因）。IBL11-12母鸡含有190bp等位基因，但无其它微卫星标记表明是6型品系的后代。IBL14-7母鸡（5只小鸡中有4只）含有全部的3个微卫星标记，表明大部分后代源于6型品系。IBL11-6公鸡含有全部的3个微卫星标记，表明后代源于6型品系。

这些结果表明，供体鸡PGCs冷冻保存后能够产生活配子和后代。

3 讨论

世界上70%的畜禽遗传资源分布在发展中国家，因战乱、政策、集约化生产、对人的健康或生命有威胁的人畜共患病、环境保护等因素，致使这些丰富的种质资源面临生存危机[3]。曲鲁江（2004）运用微卫星标记及部分品种mtDNA控制区的序列变异，对中国不同地区的78个地方鸡种的遗传多样性进行了分析，发现中国地方鸡种具有较高的多态性，平均杂合度(H)为 0.622，多态信息含量(PIC)均值为0.573。可将中国的地方鸡种分为六大类型，即西北型、华南型、西南Ⅰ型、西南Ⅱ型、华东型和华中型[4]。在过去的数十年，为了加快禽业发展，多数采用集约化生产方式，选择和应用产蛋量高、产肉速度快的品种，忽视了地方品种，致使我国20%的家禽种质资源受到不同程度的威胁[5]。在人们经济和生活水平日益提高的当代，不少的消费者喜爱“原汁原味”、有特色的地方禽种产品，但有些已经不复存在。这就说明，在不喜爱某些品种的时候要保留其遗传基因，在未来又喜爱的时候可以重新建立种群。英国对鸡的原生殖细胞冻存并重建种群的研究，对我国家禽种质资源保存有重大的启示，应当尽快开展研究和应用。

参考文献：

[1] Nandi S,Whyte J,Taylor L,et al.,Cryopreservation of specialized chicken lines using cultured primordial germ cells,Poult Sci.2016 Aug 1;95(8):1905-11.doi:10.3382/ps/pew133.

[2] MacDonald J.,Glover J.D.,Taylor L.,Sang H.M.,McGrew M.J.Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells[J].PLOS One.2010;2010;5:e15518.

[3] 王淑辉，昝林森，耿社民，等，畜禽遗传资源保存研究进展[J].黄牛杂志，2001，27:6.

[4] 曲鲁江，中国地方鸡种分子遗传多样性研究[D].北京：中国农业大学，2004.

[5] 孙莉，江苏省畜禽遗传资源现状及保护对策研究

[D].南京：南京农业大学，2008.

(原文出处：Nandi S,Whyte J,Taylor L,et al.写的 《Cryopreservation ofspecialized chicken linesusing cultured primordial germ cells》一文。 )