海人酸诱导的颞叶癫痫小鼠慢性期行为学变化△

郑捷群 甘桐嘉 孙婷婷 王鹏举 胡莹莹 许 浪

(武汉科技大学脑与认知功能实验室 武汉 430065)

癫痫是一种神经系统功能障碍综合征，其发病机制复杂，在临床上除了有癫痫症状的反复发作以外，还常伴有认知功能的损伤和情绪改变，而这种改变并不会随着癫痫发作的控制而得到改变[1～2]，因此越来越受到临床工作的重视。其中，颞叶癫痫是很多见的一种治疗难度大的癫痫，国内颞叶癫痫模型行为学研究较少见。本实验旨在通过海人酸构建小鼠颞叶癫痫模型观察其在慢性发作期的行为改变，为研究颞叶癫痫对认知功能和情绪的影响提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物和药品

健康雄性成年小鼠(C57BL/6N)，4～5周龄，体重20～22g，从湖北省疾病预防控制中心购买。海人酸(购自Sigma公司)，行为学图像采集和数据分析系统仪器购自上海欣软公司。

1.2 构建模型和动物分组

小鼠腹腔注射海人酸(10mg/kg,1mg/ml)，引发癫痫急性发作，按照Racine标准[3]给小鼠抽搐的水平分级，3级及以上为造模成功，为实验组(未达到3级的，1h后重复注射(2mg/kg,1mg/ml)直至发作达到3级为止)。注射后持续观察5h，对于连续抽搐保持1h不能自行恢复的腹腔注射镇静剂地西泮(4mg/kg)使其缓解。对照组用0.9%的生理盐水(10ml/kg)腹腔注射。在相同环境下饲养2个月后，两组各选取40只实验(n=40)。每项行为学实验对照组和实验组各10只小鼠。

1.3 行为学实验

1.3.1Morris水迷宫实验

1.3.1.1定位航行训练

前5d，两组小鼠逐个从水池的十字分割的四个象限中点处背向池中央放入池中，记录每只小鼠从四个象限出发寻找到水中可视平台的平均时间，计为逃避潜伏时间。

1.3.1.2空间探索实验

最后一天，移走可视平台。

用相同的方法将两组小鼠放入池中，记录每个小鼠在前5d所在的象限滞留的时间，计为目标象限滞留时间。

1.3.2条件恐惧实验

1.3.2.1声音联系恐惧训练实验

第1d，小鼠暴露在隔离箱里适应120s后，给予声音刺激30s并在最后两秒足部电击(0.7mA)2s，间隔20s，重复声音及电刺激循环10次。

1.3.2.2场景联系恐惧记忆实验

第2d，将小鼠放入第1d实验的环境中180s，记录小鼠在此场景中的僵直时间，计算场景联系僵直时间百分比(僵直时间百分比=僵直时间/180s)。

1.3.2.3声音联系恐惧记忆实验

第3d，用酒精擦洗隔离箱并用泡沫板垫底，将实验动物放入箱中适应120s后给予声音刺激180s，记录小鼠受到声音刺激后的声音联系僵直时间百分比(僵直时间百分比=僵直时间/180s)。

1.3.3旷场实验

内壁黑色的无顶盒子，规格为72cm×72cm×30cm，盒子底部被图像采集系统划分为25个正方形小格，小鼠从正中央的小格放入，开始实验，记录5min内活动总路程、中央区(四周无墙壁的小格)滞留时间、大小便次数。

1.3.4高架十字实验

十字迷宫的两对臂互相垂直交叉摆放，臂长度为28cm，宽度是5cm，闭臂周围有10cm高的围墙，每只小鼠被放于开臂和闭臂相交处，小鼠背对闭臂开始实验，记录5min内小鼠在开臂活动的时间比(在开臂的活动时间比=停留于开臂时间/5min)，小鼠进入开臂次数比(进入开臂次数比=进入两开臂次数/进入四个臂总次数)，进入总次数(进入四个臂总次数)。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

2.1.1定位航行训练

两组的逃避潜伏时间均逐渐减少，显示两组小鼠均具备学习能力。第1、2d，两个组的逃避潜伏期无差别；后3d，实验组小鼠的时间明显比对照组长，差异极具统计学意义(P<0.01)，见图1，表1。

图1 定位航行训练实验

组别例数1d2d3d4d5d对照组1054．80±2．6047．70±2．4034．00±2．0029．80±1．8021．80±1．00实验组1055．60±2．8049．60±2．6141．80±2．4037．20±2．0035．20±1．80

2.1.2空间探索实验显示，实验组的滞留时间为(16.96±0.85)s，明显短于对照组小鼠的(24.90±1.25)s，差异具有极显著性，见图2。

图2 空间探索实验

2.2 条件恐惧实验

2.2.1场景联系记忆实验中，实验组小鼠僵直时间百分比是(17.50±0.88)%，明显小于对照组小鼠的僵直时间百分比(60.24±3.01)%，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

图3 场景联系僵直百分比

2.2.2声音联系记忆实验中，实验组的僵直时间百分比为(49.01±2.45)%,明显小于对照组僵直时间百分比(79.57±3.98)%，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图4。

图4 声音联系僵直百分比

2.3 旷场实验

实验组活动路程(39728.464±1986.423)mm显著长于对照组的活动路程(30164.815±1508.241)mm，差异有显著性(P<0.01)，见图5。实验组中间区域滞留时间(27.068±1.353)s短于对照组的(34.523±1.726)s，有显著差异(P<0.01)，见图6。实验组大小便次数(6.125±0.306)次明显多于对照组的(2.750±0.138)次，有极显著差异，见图7。

图5 矿场活动路程

图6 中间区域滞留时间

图7 大小便次数

2.4 高架十字实验

实验组进入开臂的次数百分比是(32.00±1.60)%，对照组是(30.00±1.5)%，两者无明显差异(P>0.05)；实验组开臂停留时间百分比是(31.00±1.55)%，对照组开臂停留时间百分比是(28.59±1.43)%，两者差异均无统计学意义(P>0.05)，见图8～9。但实验组与对照组的进入开臂和闭臂的总次数(25.75±1.29)次、(33.00±1.65)次比较，有极显著差异(P<0.05)，见图10。

图8 开臂活动时间百分比

图9 开臂进入次数百分比

图10 开臂闭臂进入总次数

3 讨论

动物行为学实验能够客观地评估实验动物模型的行为，广泛应用于现代神经科学研究[4～5]。其中，Morris水迷宫实验[6～7]大多时候被用来观察小鼠的空间学习记忆能力。本研究结果显示癫痫鼠的学习记忆能力较正常鼠明显下降，这也与孙钦建[8]、钱若兵[9]等的研究结果相同。已有研究发现，颞叶癫痫患者脑结构磁共振成像中[10～11],脑结构的硬化病变波及海马旁回，杏仁核等具备认知功能部分。KA诱导的癫痫小鼠也出现类似的病理变化，此结果与临床患者表现一致，说明海人酸致颞叶癫痫小鼠行为学变化与颞叶癫痫患者的临床表现有高度吻合性，这为颞叶癫痫的研究提供了途径。条件恐惧实验是对小鼠情绪记忆的测试[12]，通过场景和声音提示引发小鼠僵直的表现从而判断恐惧情绪的出现。结果显示，癫痫小鼠的情绪记忆能力明显减弱，这种现象的出现可能与颞叶癫痫的脑组织损伤以海马区域为主相关，并且海马是被认为与空间记忆紧密联系的[13]，而受损伤的杏仁核在恐惧记忆形成的回路中也占重要地位。该结果与蔡国恩等[12]的匹鲁卡品诱导的颞叶癫痫表现相似。旷场试验中癫痫小鼠自发行为增多，探索行为减少，情绪更紧张，可以判定癫痫小鼠的焦虑抑郁状态[14～16]更明显。此结果在癫痫的戊四氮点燃模型中也有体现[17]。高架十字是用来分析动物焦虑表现的一个重要实验[18～19]，结果显示癫痫鼠开臂进入次数和滞留时间与对照组无差异，只在进入两种臂的总次数上有所减少。有趣的是，该结果与前述旷场实验实验组焦虑样行为变化明显相矛盾，这可能与小鼠所处的环境不同，产生焦虑紧张的原因不同有关[20]，这种结果也可能与癫痫慢性发作期焦虑情绪的补偿机制导致焦虑有所抑制有关，因为高架十字实验环境中小鼠处于风险决策性应答状态[21]，具体有待进一步研究。

综上所述，慢性持续的癫痫状态会明显导致小鼠的行为学改变，具体表现为学习记忆能力的降低和焦虑紧张情绪的上升，这对更深入的组织和分子层面的研究有引导意义。

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