仙珍骨康胶囊对小鼠地塞米松骨质疏松模型关键疗效指标的影响

刘 双 潘桂海 史建强 周 飞 林加西 阳慧芝 吴志华 陈嵘祎

系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病，目前仍然主要使用糖皮质激素(GC)治疗。而约30% SLE患者因此诱发糖皮质激素性骨质疏松症(Glucoeorticoid induced osteoporosis，GIOP)[1]。目前GIOP居继发性骨质疏松病因的第一位，较原发性骨质疏松症更易发生骨折或股骨头缺血坏死，甚至残疾[2]。本课题组既往采用仙珍骨康胶囊防治SLE患者GIOP取得确切的疗效，证明了中医补肾健脾法组方结合糖皮质激素治疗SLE能产生良好的协同效应来防治GIOP[3]。然而SLE合并GIOP的病因较复杂，为避免因患者病情、病程、糖皮质激素剂量、遗传背景等差异对药物的疗效造成统计学上的偏倚，为探讨仙珍骨康胶囊防治GIOP的分子机制，本研究通过建立小鼠地塞米松骨质疏松模型，并对关键疗效指标进行实时量效研究，以探讨仙珍骨康胶囊防治糖皮质激素性骨质疏松症的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与仪器 5周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠40只,体质量15～17 g,均由广东省医学实验动物中心提供,喂食普通颗粒饲料,室温20℃左右,自然光照,保持良好通风,自由进水进食。主要仪器:多模式活体成像系统(德国BRUKER，型号In-VivoXtreme),透射电镜(日本JEM-1400型透射电子显微镜)。

1.2 主要药物和试剂 地塞米松磷酸钠注射液(天津金耀药业有限公司,国药准字H12020515),仙珍骨康胶囊(由广东医科大学天然药物开发公司提供,中国专利号:201410412279.4,批准文号:粤药制字Z20070673)。仙珍骨康胶囊是由淫羊藿、蛇床子和珍珠层粉组成的中药复方制剂。具有温肾壮阳、强筋骨、袪风湿等功能，适用于阳萎遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛、妇女宫冷、寒湿带下和中老年人骨质疏松症等。I型前胶原C-端肽(PICP) 、骨钙素(BGP)、骨碱性磷酸酶(BALP)、雌二醇(E2)、降钙素(CT)、甲状旁腺激素(PTH)、孕酮(PRG)ELISA试剂盒(上海研辉生物科技有限公司), 血钙、血磷测试盒(上海合雨生物科技有限公司), Trizol(life technologies)。

1.3 分组与造模方法 将40只C57BL/6小鼠按随机分组设计原则，分为地塞米松组(A组)、仙珍骨康组(B组)、地塞米松+仙珍骨康组(C组)和对照组(D组)，每组10只。地塞米松组小鼠按1 mg/kg的剂量，每周2次臀肌注射地塞米松磷酸钠；仙珍骨康组以仙珍骨康混悬液22 mL/kg灌胃，每日1次；地塞米松+仙珍骨康组小鼠按1 mg/kg的剂量，每周2次臀肌注射地塞米松磷酸钠并以仙珍骨康混悬液22 mL/kg灌胃，每日1次；对照组正常饲养，不做处理。实验6周后处死全部老鼠。

1.4 指标检测

1.4.1 骨密度测定 处死前，给予小鼠腹腔注射10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，当小鼠呈稳定的昏睡状态达到5 min以上时，利用多模式活体成像系统对脊柱及双侧股骨近端进行X线摄片，利用自带软件进行双侧股骨近端及L2骨密度测定。

1.4.2 透射电镜观察 取右侧股骨的下1/3段，使用锐利器械从其冠状面剖成两半，3%的戊二醛固定24 h后，然后以5%的硝酸脱钙1周，送交电镜室行常规超薄切片、电镜观察。

1.4.3 血液学检测 采用10%水合氯醛将小鼠麻醉后，采用摘除眼球的方法取血，提取血清后，置于-20℃冰箱内保存。按试剂盒说明书上的方法，分别测定血清甲状旁腺激素(PTH)、I型前胶原C-端肽(PICP)、骨钙素(BGP)、骨碱性磷酸酶(BALP)、雌二醇(E2)、孕酮(PRG)、降钙素(CT)、血钙、血磷的含量。

2 结果

2.1 各组小鼠骨密度测定结果 地塞米松组股骨近端及L2的骨密度最低(P<0.01)，仙珍骨康组、地塞米松+仙珍骨康组与对照组股骨近端骨密度的差异均无统计学意义(均P>0.05)，见图1、表1。

2.2 透射电镜观察各组小鼠成骨细胞形态 地塞米松组见成骨细胞溶解，形态变长；仙珍骨康组见成骨细胞结构正常, 细胞核染色质分布均匀；地塞米松+仙珍骨康组见成骨细胞核为卵圆形，有胶原分泌；正常对照组成骨细胞可见有较多胶原分泌, 细胞中存在大量内质网及线粒体(图2)。

2.3 各组小鼠各项血液指标的结果 仙珍骨康组PTH水平最高，地塞米松+仙珍骨康组次之，其次为对照组，地塞米松组最低(P<0.0001)；仙珍骨康组PICP、BALP水平最高，其次为地塞米松+仙珍骨康组与对照组，地塞米松组最低(P<0.0001)；地塞米松组BGP、E2水平最高，其次为地塞米松+仙珍骨康组和对照组，仙珍骨康组最低(P<0.0001)；仙珍骨康组PROG水平最低，其次为地塞米松+仙珍骨康组与对照组，地塞米松组最高(P<0.0001)；地塞米松组CT水平最高，对照组次之，其次为地塞米松+仙珍骨康组，仙珍骨康组最低(P<0.0001)；各组血钙及Pi水平的差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

图1 德国BRUKER多模式活体成像系统检测各组小鼠股骨近端及L2的骨密度

图2 透射电镜观察各组小鼠成骨细胞形态

表1 各组小鼠股骨近端及L2椎体骨密度比较

表2 各组小鼠观察血液指标的检测结果

3 讨论

目前GIOP居继发性骨质疏松病因的第一位，严重影响患者生活质量，增加家庭及社会的负担，如何防治SLE合并GIOP已成临床亟待解决的难题。采用仙珍骨康胶囊防治SLE患者GIOP的确切疗效，不仅证明了复方中药制剂可有效防治GIOP，而且在GIOP发病机制的研究上取得了可喜的进展[4,5]。本课题根据“肾主骨”的中医学理论，肾虚是骨质疏松的发病关键，若肾精充足，则筋骨坚硬有力；肾虚则骨弱无力，故治疗宜补肾壮骨；脾虚则后天化源不足，五脏失养，则导致肾精亏虚，骨骼失养，骨骼脆弱无力，最终致发生骨质疏松症[6]。故宜用补肾壮骨、益气健脾的治疗法则[7，8]。本课题构建了糖皮质激素性骨质疏松动物模型从骨结构、动态、准确地观测骨质疏松疗效指标的变化，为仙珍骨康胶囊的应用提供更重要的实验依据，并大力推动GIOP的机制研究[5]。

本研究发现地塞米松组股骨近端及L2的骨密度最低(P<0.01)，仙珍骨康组、地塞米松+仙珍骨康组与对照组股骨近端的骨密度的差异均无统计学意义(均P>0.05)，血清指标示血钙与血磷浓度在各组中差异无统计学意义(P>0.05)，表明仙珍骨康胶囊可能不是从影响钙、磷离子来起到防治骨质疏松的作用。但仙珍骨康胶囊能显著升高小鼠血清中的PTH、PICP及BALP水平，下调BGP、E2、CT与PROG水平(P<0.01)。研究表明甲状旁腺素类药物比二磷酸盐类药物更能提高绝经妇女骨质疏松症病人腰椎、股骨颈BMD，改善骨质量的疗效肯定，且安全性较高[9]。此外，亦有研究表明甲状旁腺素能有效改善糖皮质激素长期应用所造成的骨量丢失，增加骨密度，对预防糖皮质激素所导致的大鼠骨质疏松有显著作用。甲状旁腺素是判断骨质疏松关键指标，仙珍骨康胶囊能显著升高PTH水平表明该药安全，高效，是SLE性糖皮质激素骨质疏松的良药[5,7]。透射电镜亦表明地塞米松组见成骨细胞溶解，形态变长；仙珍骨康组见成骨细胞结构正常, 细胞核染色质分布均匀；地塞米松+仙珍骨康组见成骨细胞核为卵圆形，有胶原分泌；对照组成骨细胞可见有较多胶原分泌, 细胞中存在大量内质网及线粒体[7,9]。

总之，上述研究活体成像、生化指标、电镜结果进一步阐明了仙珍骨康胶囊防治骨质疏松的机制。表明仙珍骨康胶囊不但能显著减低绝经前SLE患者服用糖皮质激素造成的骨质疏松或骨量减少，而且糖皮质激素耐受患者加服补骨胶囊后可以提高患者对糖皮质激素的敏感性。上述研究方法为中成药防治GIOP的研究提供了新的思路及有效的实验研究模型。为仙珍骨康胶囊的临床应用提供了大量的实验参考数据，为其分子机制的研究提供了依据。

[1] Korczowska I, Olewicz-Gawlik A, Hrycaj P, et al.The effect of long-term glucocorticoids on bone metabolism in systemic lupus erythematosus patients: the prevalence of its anti-inflammatory action upon bone resorption[J].Yale J Biol Med,2003,76(2):45-54.

[2] Elvy Suhana MR, Farihah HS, Faizah O, et al.Effect of 11β-HSD1 dehydrogenase activity on bone histomorphometry of glucocorticoid-induced osteoporotic male Sprague-Dawley rats[J].Singapore Med J,2011,52(11):786-793.

[3] 史建强, 陈丽娟, 许宗严, 等.补骨胶囊对SLE患者激素治疗后骨质疏松的作用及细胞因子表达的影响[J].中国皮肤性病学杂志,2010,24(2):169-171.

[4] Layer T, Steele A, Goeken JA, et al.Engagement of the B cell receptor for antigen differentially affects B cell responses to Toll-like receptor-7 agonists and antagonists in BXSB mice[J].Clin Exp Immunol,2011,163(3):392-403.

[5] 史建强, 陈秋霞, 黎兆军, 等.丹参联合补骨胶囊治疗系统性红斑狼疮患者骨质疏松效果[J].中国热带医学,2009,9(9):1719-1720.

[6] Lu SY, Wang CY, Jin Y, et al.The osteogenesis-promoting effects of alpha-lipoic acid against glucocorticoid-inducedosteoporosis through the NOX4, NF-kappaB, JNK and PI3K/AKT pathways[J].Sci Rep,2017,7(1):3331.

[7] Burshell AL, Mφricke R, Correa-Rotter R, et al.Correlations between biochemical markers of bone turnover and bone density responses in patients with glucocorticoid-induced osteoporosis treated with teriparatide or alendronate[J].Bone,2010,46(4):935-939.

[8] 温成平, 范永升, 唐晓颇.解毒祛瘀滋阴法防治SLE类固醇性骨质疏松症的实验研究[J].中华中医药杂志,2007,22(7):430-433.

[9] Sousa LH, Linhares EV, Alexandre JT, et al.Effects of atorvastatin on periodontitis of rats subjected to glucocorticoid-induced osteoporosis[J].J Periodontol,2016,87(10):1206-1216.