分子印迹固相萃取-高效液相色谱法检测水产品中的孔雀石绿

王丽博， 苏立强, 韩超男, 吕艳荣

(齐齐哈尔大学化学与化学工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006)

孔雀石绿(MG)能有效预防和治疗由细菌、真菌和寄生虫引起的鱼病，并且价格低廉，被广泛应用于水产养殖。但孔雀石绿具有高毒性、高残留、高致癌、致突变等危害，被指定为水生生物禁用药物。因此对孔雀石绿的灵敏准确检测十分重要[1 - 2]。目前孔雀石绿的检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、酶联免疫法等[3 - 5]。水产品组织基质复杂，常采用固相萃取(SPE)技术进行前处理，但现有固相萃取填料多为非特异性，处理效果不理想。分子印迹技术可制备对目标分子具有特异识别性的分子印迹聚合物(MIPs)，将其做为吸附材料，能选择性分离富集复杂样品中痕量分析物，有效去除基质干扰，进而提高分析的准确度和灵敏度[6 - 8]。

近几年，制备孔雀石绿印迹材料用于检测水产品的相关文献已有报道。You等[9]制备孔雀石绿磁性印迹材料，结合超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)法对鱼肉中孔雀石绿残留进行分析。张建清[10]等采用原位聚合法制备孔雀石绿印迹检测板，结合化学发光免疫分析法对海参、扇贝和蚬子中的孔雀石绿进行分离富集。沉淀聚合法制备MIPs，具有操作简单，聚合物表面洁净，吸附量高的优点。本文以孔雀石绿为模板分子，采用沉淀聚合法制备MIPs。将制得吸附容量更高的聚合物作为分离介质，自制固相萃取小柱，通过优化淋洗、洗脱条件，建立分子印迹固相萃取-高效液相色谱法，对水产品孔雀石绿残留进行分析，获得较好结果。

1 实验部分

1.1 主要仪器及试剂

P230型高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)。

孔雀石绿(MG)、隐性孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐性结晶紫(LCV)标准品(阿拉丁试剂有限公司)；正己烷、氯仿、丙酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)(分析纯，东京化成工业株式会社)；偶氮二异丁腈(AIBN)(分析纯，北京化工厂)；α-甲基丙烯酸(MAA)、乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)、冰乙酸、乙酸铵，均为色谱纯。实验用水为去离子水。

称取1 mg MG标准品，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得0.01 mg/mL标准储备液。然后取1 mL MG标准储备液于1 000 mL容量瓶中，以乙腈定容，配成0.01 μg/mL MG标准储备溶液。

1.2 MIPs的制备

取模板分子MG 0.1824 g (0.5 mmol)溶于40 mL甲醇/乙腈(1∶1，V/V)溶液中，加入功能单体MAA 0.95 mL(1.5 mmol)，室温静置12 h后，加入交联剂EDMA 1.41 mL (12 mmol)，引发剂AIBN 30 mg，超声溶解，通氮除氧15 min，密封。60 ℃水浴聚合24 h，抽滤，冷却到室温，干燥，得到聚合物。用甲醇-乙酸(9∶1，V/V) 为洗脱液进行索氏提取，直到洗脱液无色，真空干燥，得到MIPs。不加入模板分子，重复上述实验步骤，制备非印迹聚合物NIPs。

1.3 分子印迹固相萃取(MISPE)柱的制备及萃取条件优化

称取100 mg MIPs粉末均匀填入聚丙烯固相萃取(SPE)小柱中，在SPE柱底部和聚合物上方加入聚乙烯筛板，轻轻敲打使其紧实。先用5 mL乙腈和5 mL去离子水平衡SPE柱，然后将配制好的MG标准溶液过柱，考察淋洗、洗脱液条件对MISPE 小柱保留性能的影响，洗脱液干燥，溶解在流动相，HPLC法测定。

1.4 样品预处理

鱼，虾，贝类去鳞，去壳，取肌肉部分，粉碎备用。称取5.0 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈-乙酸盐缓冲溶液，1 000 r/min匀浆提取30 s振荡2 min，加5 g 酸性Al2O3，400 r/min离心10 min，取上层清液于100 mL分液漏斗，残渣加入20 mL乙腈-乙酸盐缓冲溶液，3 mL 盐酸羟胺溶液，5 mL 对-甲苯磺酸溶液，振荡2 min，400 r/min离心10 min，合并提取液，400 r/min离心10 min，45 ℃ 旋蒸近干，备用。

将碱性氧化铝柱安装在固相萃取装置上，用5 mL乙腈和5 mL去离子水活化。甲醇-乙酸溶液洗脱萃取柱，洗脱液过0.45 μm有机过滤膜，HPLC法测定。

MISPE柱依次用5 mL 乙腈和5 mL去离子水活化，在优化条件下对样品进行净化。

1.5 HPLC条件

色谱柱:SinoChrom-BP ODS柱(200×4.6 mm，5 μm)；流动相:乙腈-乙酸铵缓冲溶液(pH=4.5)(80∶20,V/V)，使用前经0.45 μm滤膜抽滤装置脱气；紫外检测波长为618 nm，进样量为15 μL，流速为0.8 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 聚合物的吸附性能

2.1.1静态吸附在温度25 ℃下，MIPs和 NIPs对MG的吸附等温线见图1a。随着MG初始浓度的增加，MIPs和NIPs对MG的吸附容量(Q)随之增加。相同浓度下，MIPs中由于存在与MG相匹配的印迹孔穴，吸附容量远大于NIPs。当MG浓度为45 μg/mL时，吸附达到饱和，MIPs的最大吸附容量达到 4.69 mg/g，高于现有方法[9 - 10]。

图1 静态吸附曲线及拟合模型Fig.1 Static adsorption curve and the fitting model a.Static adsorption curve;b.Freundlich model of MIPs;c.Langmuir model of NIPs.

MIPs和NIPs的静态吸附数据采用Freundlich模型和Langmuir模型拟合，结果如表1所示。MIPs的Freundlich吸附方程的线性相关系数R2为0.9956，与Langmuir方程相比具有更好的线性关系。因此，MIPs对MG的吸附更倾向于多分子层吸附，结合位点是非均一性的，而NIPs符合Langmuir模型，属于单分子层吸附。

表1 吸附等温模型参数

2.1.2动态吸附对聚合物动力学吸附性能进行考察(图2a)，MIPs在2.5 h达到吸附平衡，而NIPs在1.5 h达到吸附平衡。为进一步探究其吸附过程，对吸附数据进行动力学模型拟合(图2b)，由表2相关系数R2可知，MIPs符合准二级动力模型，存在着表面的物理吸附及印迹孔穴的特异性吸附，表面的物理吸附传质阻力小，吸附速率快，属于快吸附过程，而特异性吸附过程中，模板分子进入印迹孔穴时传质阻力增大，吸附速率慢，属于慢吸附过程，而NIPs符合动力学准一级模型，证明只存在表面物理吸附过程，而无特异性吸附。

图2 动力学吸附曲线及拟合模型Fig.2 Dynamic adsorption curve and the fitting model a.Kinetic curves;b.Pseudo-first-order of MIPs and NIPs;c.Pseudo-second-order of MIPs and NIPs.表2 准一级动力学方程和准二级动力学方程拟合参数Table 2 Pseudo-first-order and pseudo-second-order parameters

PolymerPseudo-first-ordermodelPseudo-second-ordermodelk1/(h-1)Q1/(mg/g)R2k2/(g/(mg·h)Q2/(mg/g)R2MIPs1.95516.860.92349.095.180.9897NIPs2.8065.7520.99182.921.690.8297

2.2 MISPE固相萃取条件优化

2.2.1淋洗溶剂条件优化考察乙腈、甲醇、正己烷、氯仿、丙酮作为淋洗溶剂时，对洗脱率的影响。结果显示，乙腈、甲醇、氯仿、丙酮为淋洗液时，在MISPE柱中MG检出量均大于20%，在NISPE柱中MG检出量均大于60%，说明这些溶剂在除去杂质和干扰物的同时损失大量目标化合物，因此不能做为淋洗液。而以正己烷为淋洗剂时，在MISPE柱上MG检出量为7.1%，在NISPE柱上MG检出量为21.2%，原因是正己烷极性弱于其他4种溶剂，对模板与印迹孔穴之间氢键破坏程度最小，因此后续实验以正己烷为淋洗液。

2.2.2洗脱溶剂条件优化参照相关文献报道[11 - 13]，选择甲醇/乙酸，甲醇/水，乙腈/水作为洗脱溶剂，结果见图3。当以甲醇/乙酸为洗脱液时，回收率最大为98.7%，原因是MG 在甲醇中有很好的溶解性，加入乙酸后，乙酸的羧基易与模板分子之间形成氢键，从而破坏功能单体与模板之间的作用力，减少MG残留，确保洗脱完全。由图中还可见，洗脱液体积为4 mL时，回收率达到最大且平衡，因此确实洗脱液体积为4 mL。

2.2.3印迹柱的性能评价为考察MISPE柱对MG选择性吸附能力，选择与MG结构类似的隐性孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐性结晶紫(LCV)为对照物，考察它们在MISPE柱和碱性Al2O3柱上的吸附容量，结果见图4。MISPE柱对模板MG吸附容量为4.78 mg/g，高于其它3种结构类似的水产药物，这说明MISPE柱对孔雀石绿有良好的特异性吸附能力；Al2O3柱对4种分析物的吸附容量十分相近，其吸附作用是非特异性的，且对于MG的吸附容量与MISPE柱有明显差距。

图3 洗脱液对回收率的影响Fig.3 Effect of eluent on the recoveries of MG

图4 MISPE柱和碱性Al2O3柱对其结构相似物的吸附容量Fig.4 Adsorption capacity of vanillin and its analogues on MISPE and Al2O3 column

2.3 水产品中孔雀石绿的检测

2.3.1线性范围与检出限实验以空白鲫鱼基质提取液稀释标准MG储备溶液，配制浓度为0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、2.5、5.0 μg/mL的MG标准工作溶液，进行MISPE-HPLC方法分析，以MG浓度(x，μg/mL)为横坐标，以峰面积(y)为纵坐标，得到的线性关系为：y=70 324x-1 004.3，R2>0.999，在0.01～5.0 μg/mL范围内线性关系良好。通过对7种空白样品进行加标实验，以大于3倍信噪比(S/N)作为检出限，求得检出限为2.01×10-3μg/mL，以大于10倍信噪比(S/N)作为定量限，计算得定量限为6.7×10-3μg/mL。

图5 鲫鱼样品色谱图Fig.5 Chromatograms of crucian carp samplea.Crucian carp sample without extraction;b.Extration by alkaline Al2O3 column;c.Extration by MISPE column.

2.3.2准确度与精密度分别在鲫鱼，鲶鱼，黄花鱼，小龙虾，基围虾，扇贝，生蚝7种水产空白样品进行加标回收实验，加入1.0、1.5、2.0 μg/mL 3个浓度水平MG溶液，测定准确度和精密度。MG加标回收率范围为81.2%～101.6%，相对标准偏差(RSD)范围为1.7%～5.4%，优于国家标准方法[11]。

2.3.3色谱行为分别以 MISPE柱和目前国家标准中常使用的碱性Al2O3柱，对加标的小龙虾肌肉样品中的MG进行分离富集，结合HPLC法分析，其色谱图见图5。经 MISPE和碱性Al2O3柱处理后，均有效去除了基质干扰，但MISPE柱富集倍数更高，去除杂质效果更好。这是因为 MISPE柱的印迹填料内存在与 MG结构匹配的记忆孔穴，对 MG显示出高选择性，这正是分子印迹聚合物的特点所在。

3 结论

以MG 为模板分子，MAA为功能单体，采用沉淀聚合法，制备了 MG分子印迹固相萃取填料。在MISPE优化条件下，应用于水产品中 MG检测的样品净化。结果表明，MISPE 萃取效果优于传统碱性Al2O3柱，表现出对MG优异的净化效果和富集能力，为富集水产品中MG残留，提供了新材料。

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