NMHC-ⅡA在PRRSV感染M arc-145细胞过程中的作用

李 红,刘成倩,孙凤萍,高 骏,易建中*

（1上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）感染所致的一种接触性传染病，主要表现为母猪发热、厌食、流产、早产、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍及仔猪和猪呼吸系统疾病［1-3］。已公布的 PRRSV受体中，存在于猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophages，PAM）的 3个受体分别为硫酸乙酰肝素 （Heparin sulfate，HS）［4-5］、唾液酸黏附素（Sialoadhesin，Sn）［5-6］和清道夫受体 CD163［7］，存在于 PRRSV易感染细胞系 Marc-145上的受体为 CD151和波形蛋白（Vimentin）［8-9］。目前，PRRSV与受体之间相互作用的分子机制还不完全清楚，普遍认为HS能够调节低水平病毒的吸附，但并不能将病毒内吞。Sn能够调节病毒的吸附和内吞，但并不能将病毒内吞，且不需要硫酸乙酰肝素的协助。CD163受体的作用可能是协助唾液酸黏附素内吞、PRRS病毒脱衣壳以及基因组RNA的释放［10］。

存在于非肌肉细胞中的肌肉蛋白II称为非肌肉肌球蛋白Ⅱ（Non-musclemyosinⅡ，NMⅡ），其与肌动蛋白结合构成细胞中的分子马达［11-12］。研究发现，NMⅡ在囊泡的转移和释放、细胞吞饮、病毒入侵等方面也有一定的作用［13-14］，但NMⅡ其他功能研究较少。非肌肉肌球蛋白重链Ⅱ型（Non-muscle myosin heavy chain-Ⅱ，NMHC-Ⅱ）广泛分布在生物体内，参与细胞迁移、黏附、胞质分裂等各种生理活动［15］。NMHC-Ⅱ有NMHC-ⅡA、NMHC-ⅡB、NMHC-ⅡC 3种不同的亚型，它们具有相似的结构，均为由一对大小为171—244 ku的重链和两对大小为16—23 ku的轻链组成的六聚体，其中NMHC-ⅡA的重链大小为230 ku［16］。2008年周恩民等［17］首次提出NMHC-ⅡA可能是PRRSV的受体或辅助因子，为了进一步研究该蛋白在PRRSV感染宿主细胞中的作用，本试验以NMHC-IIA为研究对象，探讨其与CD163受体的关系以及在PRRS病毒感染过程中的定位。

1 材料与方法

1.1 细胞、毒株、抗体以及试剂

Marc-145细胞系为本实验室保存；PRRSV 12#毒株（GenBank：HQ416720）、抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体（6D10）以及PRRSV阳性猪血清（345#）为山东农业大学免疫生物学实验室提供；抗PRRSV GP5抗独特型抗体Mab2-5G2由西北农林科技大学周恩民教授提供；二抗HRP-羊抗猪IgG和FITC-标记羊抗鼠IgG购自Jackson公司；G-cy5标记的羊抗鼠二抗购自SoutherBiotech公司；Vectashield包埋试剂购自Vector labs公司；其他常规试剂均为国产分析纯。

1.2 免疫共沉淀提取NMHC-ⅡA

将Marc-145细胞从细胞培养瓶上轻轻刮下，3 000 r/min离心10min，收集细胞，PBS缓冲液（0.01mol/L，pH 7.2）重悬细胞，洗涤3次，使细胞达4×107个左右。加入RIPA细胞裂解液［18］1 mL重悬细胞，放入-70℃冰箱反复冻融裂解细胞3次，转入4℃摇床上轻摇30 min，离心，收集上清液，并加入50μL用RIPA洗涤3次的Resin，放入4℃摇床上轻摇1 h，离心，收集上清，加入5μLMab2-5G2（11 mg/mL），4℃轻摇孵育14—16 h，加入Resin 50μL，4℃轻摇孵育4 h，离心，收集沉淀物，加入1 mL RIPA洗涤沉淀，离心，弃上清，洗涤3次。取Resin 10μL于试管中，进行SDS-PAGE检测。

1.3 SDS-PAGE蛋白电泳检测NMHC-ⅡA

参照分子克隆实验指南操作制备8%分离胶和5%积层胶，进行凝胶染色和脱色［19］。按照电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板，灌胶、电泳。

1.4 W estern Blot检测NMHC-IIA

按照1.3 SDS-PAGE的步骤制备凝胶及电泳。将分离胶放入电转缓冲液中，按照实验室常规半干转膜法转PVDF膜［19］。取出的膜放入含2.5%脱脂奶粉的PBST中，封闭1 h。将膜放入含有Mab2-5G2的抗独特型抗体中，孵育1 h。PBST洗涤3次，每次5 min。PVDF膜放入HRP标记羊抗鼠的二抗中孵育1 h。PBST洗涤3次，每次5 min。将膜放入底物中显色，用去离子水终止反应。

1.5 NMHC-IIA与PRRSV的检测

按照2×105个/mL含量培养Marc-145细胞于含有盖玻片的细胞培养板内，24 h后，100μL细胞液接入100 TCID50的PRRSV，细胞板转入4℃孵育1 h，然后放入37℃、5%CO2培养箱内培养不同时间，分别于 0 min、5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min用预冷的 75%乙醇 4℃固定 30 min，弃去细胞板内乙醇，超净工作台内吹干。固定细胞于0.5%TritonX-100，室温处理5 min，PBS洗涤3次，每次5 min。加入阻断缓冲液［18］，室温放置1 h，PBS洗涤3次，每次5min。细胞按照一定稀释度加入Mab2-5G2（1 mg/mL）和PRRSV阳性猪血清345#（1∶160），室温孵育1 h，PBS洗涤3次。将稀释好的G-cy5标记的羊抗鼠和FITC标记的羊抗猪二抗（G-cy5-羊抗鼠IgG：1μg/106个细胞，FITC-羊抗猪IgG：1μg/106个细胞）加入到细胞上，室温孵育1 h，PBS缓冲液洗涤3次。将细胞板内盖玻片取出，将盖玻片上细胞包埋在Vectashield包埋试剂中，用指甲油包封闭盖玻片，于激光共聚焦显微镜下观察、拍照。

1.6 NMHC-IIA与CD163片段的相互作用

将按照1.2方法提取的NMHC-IIA蛋白进行SDS-PAGE，然后转入PVDF膜，将转好的膜放于2.5%脱脂奶粉中4℃孵育过夜。膜用0.5%PBST洗涤3次，每次10 min，加入纯化的M1、M2、M3蛋白［20］，室温孵育2 h，用0.5%PBST洗涤3次，每次10 min。加入Mab2-5G2或抗HIS标签的单克隆抗体，室温孵育2 h后，洗涤3次，每次10 min。加入羊抗鼠-HRP标记的二抗，室温孵育1 h后，加入增强型HRP-DBA底物显色液进行检测。

2 结果与分析

2.1 NMHC-ⅡA蛋白的提取与检测

通过免疫共沉淀技术获得beads-5G2-NMHC-ⅡA蛋白复合物，将此蛋白复合物洗脱、中和，获得纯化的NMHC-ⅡA蛋白，取适量NMHC-ⅡA蛋白进行SDS-PAGE电泳。如图1所示，NMHC-ⅡA蛋白大小为230 ku。

2.2 NMHC-IIA与PRRSV感染关系

图1 SDS-PAGE检测M arc-145细胞中NMHC-IIAFig.1 Detection of NMHC-IIA in M arc-145 cells by SDS-PAGE

分别通过绿色和红色荧光二抗（FITC-标记的羊抗猪和CYTM5-标记的羊抗鼠）检测在PRRSV感染Marc-145细胞时，NMHC-ⅡA蛋白在细胞中的位置和表达量。通过激光共聚焦显微镜发现：将细胞转入4℃时，PRRS病毒主要分布在被感染细胞表面，当细胞从4℃转入37℃时，PRRS病毒在5 min左右进入细胞。随着病毒感染细胞时间的延长，NMHC-ⅡA蛋白在Marc-145细胞内的表达量增加；当PRRS病毒完全进入被感染细胞后，NMHC-ⅡA的表达量减少（图2）。

图2 NMHC-ⅡA蛋白在PRRSV感染M arc-145细胞中的分布和表达量Fig.2 Distribution and expression of NMHC-ⅡA protein in M arc-145 cells infected with PRRSV

2.3 NMHC-ⅡA蛋白与CD163蛋白的相互作用

将纯化的NMHC-ⅡA蛋白与CD163分段蛋白（M1、M2、M3）孵育1 h后，经免疫共沉淀试验发现：NMHC-ⅡA蛋白与M1和M3蛋白能够相互作用，与M2蛋白没有相互作用（图3）。

图3 Western Blot检测NMHC-ⅡA和CD163片段的相互作用Fig.3 Detection of interaction between NMHC-ⅡA and CD163 fragments by Western Blot

3 讨论与结论

目前，PRRSV感染致病机制尚不清楚。病毒感染宿主细胞，主要是通过与细胞表面的特异性受体结合，利用细胞的内吞作用感染易感细胞。PRRSV感染易感细胞系非洲绿猴肾细胞Marc-145的过程也是通过细胞表面的受体进行的，但已有报道称Marc-145细胞系上没有Sn受体［21］。PRRSV能够感染Marc-145细胞，说明PRRSV可能与Marc-145细胞上的其他受体或者辅助因子相互作用继而引起PRRSV感染和进入细胞。Kim等［22］研究发现，波形蛋白存在于Marc-145细胞表面，并能够与PRRSV的N蛋白相互作用，说明波形蛋白参与PRRSV感染Marc-145细胞的过程。周恩民等［17］通过免疫共沉淀技术，利用PRRSV结构蛋白GP5的单克隆抗独特型抗体Mab2-5G2，从PAM和Marc-145细胞中提取获得非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（NMHC-ⅡA）。本研究发现，Marc-145细胞上的PRRSV受体CD163与NMHC-ⅡA蛋白能够相互作用，作用位点主要集中在CD163蛋白的M1（20—259 aa）和M3（714—1 040 aa）蛋白上。同时，通过激光共聚焦显微镜定位发现，NMHC-ⅡA蛋白在PRRSV感染细胞过程中随着感染时间的延长和病毒感染量的增加，其表达量也有所增加。本试验认为，NMHC-ⅡA蛋白可能在PRRSV感染Marc-145细胞过程中发挥协同作用。本研究进一步揭示了PRRSV受体或协同因子之间的相互作用，对PRRSV感染致病机制有一定的促进作用。后期可以进一步缩短结合蛋白的长度，找到相互作用位点，利用RNAi技术敲除结合位点，从而减少病毒侵染宿主细胞的机会。

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