不同NAA和6-BA对牡丹胚性愈伤组织诱导的影响

孟新亚，王 政，何松林,2*，贺 丹，娄雪源，宋盈龙

(1.河南农业大学 林学院，河南 郑州 450002；2.河南科技学院，河南 新乡 453003)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)为芍药科芍药属名贵观赏和药用木本花卉，花大而美，有“花中之王”的美誉[1]。迄今为止，牡丹的组织培养已有大量研究[2-7]，主要集中在品种的选择[8-10]、外植体遗传因素的影响[11-12]、外植体的种类及取材时间[13-15]、基本培养基类型及生长调节物质[16-18]、环境因子调控[19-21]等方面，但尚未建立起高效稳定的再生体系。

体细胞胚胎发生具有数量多、繁殖速度快、结构完整、植株再生率高、不受季节影响等特点，是植物大规模繁殖的主要手段之一[22-25]。目前，胡萝卜、拟南芥、龙眼等都建立了体胚发生及再生植株培养体系，且发现提高非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转化率是建立其体胚间接发生途径的关键步骤之一[26-28]。在大花蕙兰[29]、枸杞[30]等植物体胚发生过程中发现适宜的激素浓度可以促进体胚的发生，频率有一定的影响。另外，有研究表明，超氧物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性和可溶性蛋白含量变化与胚性愈伤组织的诱导及体胚发生的频率密切相关[31-34]。但目前牡丹尚未建立体细胞胚发生途径，非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转化率是限制因子之一[35-38]。因此，本试验以牡丹品种‘凤丹白’愈伤组织为材料，拟探究不同6-BA和NAA比例及浓度处理对胚性愈伤组织诱导及抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性和可溶性蛋白含量的影响，以期为探索牡丹非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转化的可行条件和建立稳定的牡丹体胚发生体系提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以牡丹品种‘凤丹白’(P.suffruticosa‘Fengdanbai’)未萌动鳞芽为外植体(采自洛阳神州牡丹园苗木基地)，获得试管苗，然后转入1/2MS+Ca2+(WPM)+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L(pH=5.8)的固体培养基上培养40 d，获得愈伤组织。将诱导出的愈伤组织转入1/2 MS+Ca2+(WPM)+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L(pH=5.8)的固体培养基上增殖培养后作为供试材料。

培养条件：温度(24±1)℃,光强 40 μmol/(m2·s)，光照时间12 h/d。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 本试验以1/2 MS+Ca2+(WPM)+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L为基本培养基，外源添加不同比例和浓度的NAA和6-BA为处理，以CK为对照，共设置10个处理(表1)。将供试的愈伤组织材料分别接种于不同处理培养基中，并分别于培养的第0、5、10、15、20、25和30天取样，测定POD、SOD和CAT活性，各处理重复3次。

表1 牡丹胚性愈伤组织诱导过程中NAA和6-BA不同浓度配比

1.2.2 指标测定及统计分析 采用愈创木酚法测定POD活性[39]；氮蓝四唑(NBT)法测定SOD活性[40]；KMnO4法测定CAT活性[40]；可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法[39]测定，每项指标测定均重复3次，取其平均值。利用石蜡切片法[41-42]进行细胞形态学观察。

1.3 数据分析

试验数据采用DPS 7.05和Excel 2003进行处理分析，均采用邓肯氏新复极差测验法(SSR法)测验其差异显著性，显著水平P≤0.05。

2 结果分析

2.1 解剖结构观察

通过细胞学观察发现，不同激素处理对牡丹‘凤丹白’胚性细胞发生时间的影响存在显著差异，且诱导效果差异较大，以处理8(NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)效果为最佳。此处理下，第20天开始出现胚性细胞(图1A)；第25天胚性细胞大量出现，并与非胚性细胞共存(图1B)；第30天出现胚性细胞、非胚性细胞和早期球形胚共存的现象，其中非胚性愈伤组织的细胞排列疏松、液泡较大，形状不规则，而胚性愈伤组织细胞小，排列紧密，细胞核较大，为细胞分裂提供物质基础，有利于体胚的进一步发育(图1C)。

图1 不同浓度NAA和6-BA处理下牡丹体胚发生的细胞学观察Fig.1 Cytological observations of the different concentration ratios of NAA and 6-BA in the induction process of peony embryo callus

2.2 抗氧化酶活性的变化

2.2.1 POD活性 不同浓度NAA和6-BA处理对牡丹‘凤丹白’愈伤组织POD活性变化的影响存在显著差异(表2)。各处理中POD活性整体呈现“下降—上升—下降—上升”或“上升—下降—上升”的趋势。但处理4和6整体呈下降趋势；处理9在1～5 d达到峰值，然后反应值于20 d(胚性细胞出现时间)降到最小值后有所上升，和其它处理的变化趋势相反。处理1、2、3、5、6和8均在起始阶段呈下降趋势，但达到极小值的时间多集中于5～10 d，而后再于15～20 d达到最大值，这与胚性细胞出现时间相同；其中处理3和8的POD活性在第20天达到最大值后保持较高水平，并且于25～30 d分别是其它处理平均水平的1.8～2.3倍。

表2 不同浓度NAA和6-BA对牡丹体胚发生过程中POD活性变化的影响

同列数据后标不同字母表示处理间差异显著(P<0.05；n=3)。下表同。

Different letters indicate significant differences between treatments atP<0.05(n=3).The same as below.

2.2.2 SOD活性 不同浓度NAA和6-BA处理对牡丹‘凤丹白’愈伤组织SOD活性变化的影响差异较大(表3)。大多数处理的SOD活性整体呈“上升—下降”趋势；而处理CK和8整体呈上升趋势。各处理间SOD活性达到最大值的时间亦不同，处理1和9的SOD活性达到最大值的时间是第5天，而后呈下降趋势，特别在20～30 d之间呈显著下降趋势；处理2、3、4、5、6和7达到最大值的时间虽然与处理1和9不同，但在20～30 d之间的变化趋势类似。处理CK与处理8均呈上升趋势且于第30天达到最大值，但二者上升趋势不同：处理CK呈波浪式上升趋势，且在第25天达到仅次于第0天的极小值；而处理8整体处于一直上升趋势，且在第15天开始显著高于0～10 d的SOD活性；其变化趋势与胚性细胞出现以及形成时间重合。

表3 不同浓度NAA和6-BA处理下牡丹体胚发生过程中SOD活性变化的影响

2.2.3 CAT活性 不同浓度NAA和6-BA处理对牡丹‘凤丹白’愈伤组织CAT活性变化的影响存在显著差异(表 4)。各处理CAT活性整体呈现“下降—上升—下降—上升”或“上升—下降—上升”的趋势。但处理CK和6于第1～5天达到最大值后整体呈下降趋势，且处理CK下降的最小极值处于第20天(胚性细胞出现时间)；处理9在1～5 d达到峰值后于第10天降到最低值，然后呈上升趋势，但在第20天的反应值仍低于第5天；处理1、3、4和5均在第25天达到峰值，其中处理1和4的最小极值均出现在第20天，处理3和5的最小极值分别在第10天和第5天；而处理2和8反应的最大值均出现在20 d，其中处理2在20 d之前的变化趋势不稳定且整体反应值处于较低水平，处理8在0 d后反应值一直呈上升趋势，于20 d达到峰值后虽有所下降但整体保持较高水平，并且于25～30 d的CAT活性是其它处理平均活性的2.53～8.89倍。

表4 不同浓度NAA和6-BA处理下牡丹体胚发生过程中CAT活性变化的影响

2.3 可溶性蛋白含量的变化

不同浓度NAA和6-BA处理对牡丹‘凤丹白’愈伤组织可溶性蛋白活性变化的影响各不相同(表 5)。大部分处理的可溶性蛋白含量整体呈现“下降—上升—下降—上升”或“下降—上升—下降”的趋势，只有处理9在1～5 d呈上升趋势后下降，20 d(胚性细胞开始出现时间)的反应值低于0 d，于25 d急速上升到峰值后下降到最小极值。处理1于15 d达到峰值后于25 d(胚性细胞大量出现时间)降到最小极值；处理2于10 d达到最大值后于20 d降到最小值；处理5在5～25 d的可溶性蛋白含量不稳定，于20 d降到最小极值后到第25天反弹到最大反应值；处理6于第10天升到最大值后开始下降并于30 d(早期球形胚出现时间)降到最小极值。而处理CK、3、4、7和8均在1～5 d出现最小极值，其中处理CK于25 d升到峰值后下降；处理3和7均于25 d达到峰值，且5～25 d之间的反映值不稳定，呈现忽高忽低的变化趋势；处理4和8均于30 d达到峰值，其中处理8在5 d后一直呈上升趋势，处理4在20～30 d的反映值不稳定且整体反应值低于处理8。

表5 不同浓度NAA和6-BA处理下牡丹体胚发生过程中可溶性蛋白含量的影响

3 结论与讨论

研究表明，SOD、POD及CAT与体细胞胚的诱导、分化以及成熟都存在密切关系[43]。POD与能量和呼吸代谢密切相关，在体细胞胚胎发生过程中起着重要的调节作用，许多植物在体胚发生过程中，POD表现出较高活性[44-47]。SOD参与细胞的分裂和分化，对体细胞胚的分化发育起促进作用[48-49]。CAT与细胞分裂、分化及多细胞原胚和球形胚的发育有关。胚性愈伤组织的形成需要大量的蛋白质合成，可溶性蛋白的积累能为胚性愈伤组织的进一步发育提供物质和能量基础[47]。

本研究发现，愈伤组织在体细胞胚发生过程中，抗氧化酶类活性变化效果不同，但整体均有效缩短了延迟期，其中以添加NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L的处理8效果最好，该处理条件下诱导培养的愈伤组织于第20天开始有胚性细胞形成(图1A)，第25天出现大量胚性细胞(图1B)，第30天有少量早期球形胚形成(图1C)。POD活性在0～20 d变化较剧烈，于20 d达到最大值后略有下降，但仍维持在较高水平，即POD活性在胚性细胞形成初期有所上升，随后缓慢下降，这与王静等[50]的研究结果一致。

张慧君等[51]研究橡胶树体细胞胚发生中抗氧化酶活性的变化时发现，SOD活性值的增加对胚性细胞的分化和发育有一定的促进作用。詹园凤等[32]对大蒜胚性细胞发生的研究表明，在胚性愈伤组织分化时期，SOD的活性会升高，而当其分化为体细胞胚胎后，SOD会达到峰值。由此可以说明，SOD活性值的增加对胚性细胞的分化发育具有一定的促进作用[52-56]。本研究发现在牡丹愈伤组织体胚发生过程中，处理8的SOD在0 d后一直呈上升趋势且于30 d升到峰值，此时正是胚性细胞出现到大量形成的时期，这和崔凯荣[30]的研究一致。

张建瑛等[31]在研究胡桃楸体胚发生过程中指出，高水平的CAT活性对多细胞原胚和球形胚的形成和发育有促进作用。本研究发现，处理8的CAT活性在0～20 d变化较剧烈，20～25 d迅速上升达到最大值，CAT活性的升高能够促进胚性细胞的形成和早期发育，这与张建瑛等[31]的研究结论一致。

小麦的胚性愈伤组织形成后到球形胚一直保持较高的蛋白质水平，而且蛋白质的合成速率明显高于非胚性愈伤组织[57]。在水稻胚性愈伤组织中，水溶性蛋白质含量远远高于非胚性愈伤组织，即使胚性愈伤组织继代10次后，蛋白质含量会有所下降，但仍高于非胚性愈伤组织[58]。在石刁柏的体细胞胚发生中可溶性蛋白在球形胚时期可溶性蛋白质含量最高[47]。本研究中可溶性蛋白的含量也以处理8表现最好，在20～30 d之间保持较高含量，且在30 d有球形胚出现时达到最大值，这与杨和平等[47]的研究相符合。

可见高水平的抗氧化酶类活性和可溶性蛋白含量有利于牡丹‘凤丹白’愈伤组织由非胚性愈伤向胚性愈伤的转变，促进球形胚形成，显著加快胚性愈伤的生长发育速度，POD、SOD、CAT和可溶性蛋白之间彼此作用、相互协调，共同促进体胚的生长发育过程。

因此，本研究认为外源添加NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L对牡丹‘凤丹白’牡丹愈伤组织的诱导效果最佳，显著提高其抗氧化酶类的活性和胚性细胞的诱导水平，促进胚性细胞的形成和发育，为后期体胚发生相关研究提供理论依据和技术支持。

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