龙岩烤烟特征香气成分及其关键生态影响因子研究

陈爱国，刘光亮，周道金，谢凤标，彭国华，郭学清，蒋代兵，李琦瑶,3，沈少君，吴树松,曾文龙*

(1.中国农业科学院烟草研究所/农业部烟草生物学与加工重点实验室，山东 青岛 266101；2.福建省烟草公司龙岩市公司，福建 龙岩 364000；3.中国农业科学院研究生院，北京 100081)

烟叶香气成分是烟气香气质量的基础[1]。烟叶香气成分主要有五大类：类胡萝卜素降解物、类西柏烷类降解物、芳香族氨基酸代谢产物、美拉德产物和叶绿素降解产物新植二烯，其中，源于类西柏烷类降解的茄酮和降茄二酮，和源于类胡萝卜素降解的巨豆三烯酮、大马酮、香叶基丙酮及紫罗兰酮等是烟草中最重要的香气成分[2]。尽管关于主体香气成分的研究结果不尽一致，还是可以看出表征香气成分主要指向了巨豆三烯酮、茄酮和大马酮；我国烤烟巨豆三烯酮含量比较稳定，茄酮和大马酮则含量变化较大，茄酮在浓香型烟叶中含量较高，大马酮在清香型烟叶中含量较高[3]。烟叶中的大马酮主要为β-大马酮和β-二氢大马酮，其前体物为萜类物质中的类胡萝卜素，其中β-胡萝卜素在C6-C9位置断裂、叶黄素在C6-C7和C21-C22位置断裂、新叶黄素在C9-C10位置断裂降解，均可转化成大马酮[4]。因此，类胡萝卜素代谢产物是研究清香型烟区特征香气成分的重点关注对象。此外，在清香型烟叶中，还有一些酮类、酯类、饱和高级脂肪酸和吡啶类降解产物也是重要的清香型烟叶的特征香气成分，如香叶基丙酮、紫罗兰酮、氧化异佛尔酮、二氢猕猴桃内酯、棕榈酸和吡啶醛类等[2]。

烟草香气成分主要为次生代谢产物的降解产物[1]，其前体物的生物合成和积累主要受生态、品种和栽培调制技术等影响[5-7]。次生代谢是植物在长期进化过程中为了应对生物和非生物胁迫而演化出来的生物过程，通常都与特殊的组织和特定的生物功能密切相关[8]。如低纬度起源的烟草，内含的不饱和键类胡萝卜素对烟叶避免强光伤害具有强烈的保护作用[9]，叶面密布的腺毛是合成和贮存各种类型次生代谢产物的重要场所[8]。因此，对于特定的植物，生态是决定次生代谢产物的第一要素。前人[10-11]对生态环境与烟叶香气成分及其前体物的关系开展了广泛的研究，主要集中在特征香气成分指标筛选和香气成分前体物与生态的相关关系两个方面。然而，香气成分前体物在烘烤环节降解产生了包括特征香气成分在内的众多香气成分[12]，单一地通过特征香气成分的前体物与生态因素的关系来评价特征香气成分的生态成因，显然是不妥的。目前，探讨特征香气成分及其与生态因素的时间序列关系研究未见报道。本研究通过对典型东南清香型的龙岩烤烟与典型西南清香型的大理烤烟在香气成分上的差异比较，筛选特征香气成分，分析生态因子对特征香气成分的影响，探讨关键生态影响因子，为揭示烤烟香气风格的生态机制奠定理论基础，进而为我国特色优质烟叶开发提供实践依据和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2013—2014年安排在福建龙岩的长汀、上杭、永定，参试材料为CB-1、C2、闽烟35、FL88f、云烟87、闽烟57、闽烟38、FL25和F31-2共9个品种(系)54个样本。2012—2013年在云南大理州12个县(市)，共采集了云烟87、K326和红花大金元3个品种160个烤烟样本。每个样本对应的试验田块定点采集了植烟前土壤样品1.5 kg和烤后中桔三(C3F)烟叶样品2.5 kg，分别检测土壤化学成分和烤后烟叶香气成分。

1.2 气象数据来源

龙岩市和大理州连续15年的旬气象资料(2000—2014年)分别由龙岩市气象局和大理州气象局提供。

1.3 土壤样品的采集及化学成分检测

植烟前耕作层土壤样品采集参照NY/T 1121.1—2006方法制备。全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷、速效钾、水溶性氯、有机质、pH、交换性钙和镁、有效硼、有效铜和有效锌共14项土壤化学成分，分别参照GB7173—1987、GB837—1988、GB9836—1988、LY/T 1229—1999、NY/T1121.7—2006、LY/T1236—1999、NY/T1121.17—2006、NY/T1121.6—2006、NY/T1121.2—2006、NY/T1121.13—2006、NY/T1121.8—2006、LY/T1260—1999和LY/T1261—1999标准检测。

1.4 烟叶香气成分检测

1-戊烯-3-酮、3-羟基-2-丁酮、3-甲基-1-丁醇、吡啶、3-甲基-2-丁烯醛、己醛、面包酮、糠醛、糠醇、2-环戊烯-1,4-二酮、1-(2-呋喃基)-乙酮、丁内酯、2-吡啶甲醛、糠酸、苯甲醛、5-甲基糠醛、2,4-庚二烯醛A、4-吡啶甲醛、1H-吡咯-2-甲醛、2,4-庚二烯醛B、苯甲醇、苯乙醛、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、芳樟醇、壬醛、1-(3-吡啶基)-乙酮、苯乙醇、氧化异佛尔酮、2,6-壬二烯醛、苯并[b]噻酚、藏花醛、胡薄荷酮、2,3-二氢苯并呋喃、吲哚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、茄酮、β-大马酮、β-二氢大马酮、去氢去甲基烟碱、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、丁基化羟基甲苯、2,3′-联吡啶、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮 A、巨豆三烯酮 B、巨豆三烯酮 C、巨豆三烯酮 D、3-氧代-α-紫罗兰醇、十四醛、蒽、茄那士酮、新植二烯、邻苯二甲酸二丁酯、金合欢基丙酮 A、金合欢基丙酮 B、棕榈酸甲酯、棕榈酸、棕榈酸乙酯、寸拜醇、亚麻酸甲酯、植醇和西柏三烯二醇共63项香气成分参照《烟草及烟草制品 致香成分的测定同时蒸馏萃取-气相色谱质谱联用法》TCJC-ZY-Ⅳ-014—2012方法检测。

项目组同时采集了相同检测方法检测的湖北恩施、福建南平的2011年清香型烤烟香气成分数据，作为进一步比对的数据。4个产区香气成分指标共性指标有：吡啶、吲哚、糠醛、苯甲醛、芳樟醇、5-甲基糠醛、氧化异佛尔酮、新植二烯、γ-丁内酯、β-大马酮、β-二氢大马酮、香叶基丙酮、苯甲醇、苯乙醇、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮-A、巨豆三烯酮-B、巨豆三烯酮-C、巨豆三烯酮-D、棕榈酸和棕榈酸甲酯共21项指标。

1.5 数据整理与分析

数据整理采用Excel 2007，灰色关联度分析采用matlab R2016a，Duncan多重比较采用SAS 9.0。生态因子的贡献率采用平方和贡献率计算方法，贡献率=SS变因×100%/(SS总-SS误-SS区组)。

2 结果与分析

2.1 龙岩和大理生态基本条件

生育期测量调查参照YC/T 142—2010标准。龙岩烤烟均为1月20日移栽，大理烤烟均为5月1日移栽；还苗伸根期、团棵前期、团棵中期、团棵后期、旺长前期、旺长中期、旺长后期、打顶期、下部叶成熟期和中部叶成熟期每个阶段均为10 d；中部叶生育期(中部叶从出现至成熟)为进入团棵中期至中部叶成熟采收。各生育期对应的气象数据和植烟前耕作层土壤化学成分数据见表1。

表1 龙岩和大理生态因子指标及含量

续表1 Continued tab.1

由表1可见，龙岩烟区总体表现为成熟期前气温较低，降雨较多，日照时数较少，土壤pH较低。与大理州气象条件比较，龙岩烟区旬平均气温在还苗伸根期至下部叶成熟期较低，旬日照时数在还苗伸根期至中部叶成熟期较少，旬空气相对湿度总体呈旺长后期之前较高，旺长后期之后较低，旬降雨量除团棵中期和中部叶成熟期较低外，其它生育期均较高。与大理州土壤化学比较，龙岩烟区pH、全钾、速效钾、交换钙、交换镁和有效硼较低，速效氮、速效磷、有效铜和有效锌较高。

2.2 龙岩烤烟特征香气成分的筛选与评价

2.2.1 龙岩特征香气成分的筛选 由表2可见，与大理州烟叶香气成分比较，龙岩烟叶中吡啶、糠醛、2-环戊烯-1,4-二酮、1-(2-呋喃基)-乙酮、丁内酯、2-吡啶甲醛、苯甲醛、4-吡啶甲醛、1H-吡咯-2-甲醛、2,4-庚二烯醛B、苯甲醇、苯乙醛、苯乙醇、氧化异佛尔酮、β-大马酮、β-二氢大马酮、β-紫罗兰酮、2,3'-联吡啶、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮 B、巨豆三烯酮C、巨豆三烯酮D、3-氧代-α-紫罗兰醇、十四醛、茄那士酮、新植二烯、金合欢基丙酮A、棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯、亚麻酸甲酯和植醇共31项指标的含量较高。Duncan多重比较分析表明，4-吡啶甲醛、2-吡啶甲醛、氧化异佛尔酮、β-大马酮、β-二氢大马酮和棕榈酸甲酯共6项指标的含量在龙岩烟叶中表现显著较高。

结合湖北恩施和福建南平烟叶香气成分数值，氧化异佛尔酮、β-大马酮和β-二氢大马酮含量在龙岩烟区含量相对最高，棕榈酸甲酯含量则在南平烟叶中含量最高。4-吡啶甲醛和2-吡啶甲醛含量表现龙岩高于大理，但缺少恩施和南平相关数据，在福建烟区无法确定这2项指标是否是龙岩特色香气成分。吡啶类在浓香型卷烟烟气中的含量是超清香卷烟烟气中的6倍左右[13]，因此，不太可能是龙岩典型清香型烟叶的特征香气成分。因此，氧化异佛尔酮、β-大马酮和β-二氢大马酮可以作为龙岩烟叶的特征香气成分。

表2龙岩与大理烤后C3F烟叶致香成分及含量

Tab.2 Aroma components of C3F raw tobacco leaves in Longyan and Dali and their contents μg/g

续表2 Continued tab.2

*表示P<0.05水平差异显著，**表示P<0.01水平差异显著。

*represents significant at 0.05 level,and **represents significant at 0.01 level.

2.2.2 龙岩特征香气成分的区域间和品种间变化 从图1可见，不同区域间，特征香气成分均无显著差异。从图2可见，不同品种间仅氧化异佛尔酮含量存在显著差异，主要表现在含量较高的闽烟38和含量较低的CB-1、C2、闽烟35和F31-2之间。品种与区域区组方差分析表明，总体上品种间(F=2.40，P=0.122 6)与区域间(F=2.07，P=0.102 3)均无显著差异，因此，氧化异佛尔酮含量的品种间差异与品种×区域互作有关。综合分析表明，这些特征香气成分是龙岩烟区共同的特征香气成分，品种对彰显特色有一定的影响。

不同小写字母表示P<0.05水平差异显著，相同字母表示差异不显著Different small letter represents significantly different(P<0.05),same small letter represents not significantly different(P<0.05)图1 龙岩烤烟特征香气成分的区域间差异Fig.1 Regional differences of the characteristic aroma components in Longyan flue-curing tobacco

不同小写字母表示P<0.05水平差异显著，相同字母表示差异不显著Different small letter represents significantly different(P<0.05),same small letter represents not significantly different(P<0.05)图2 龙岩烤烟特征香气成分的品种间差异Fig.2 Varietal differences of the characteristic aroma components in Longyan flue-curing tobacco

2.3 龙岩特征香气成分与生态因子的关系

生态条件变化是时间序列的变化，具有连续性和累加效应；这种影响在时间序列上累加直至出现显著差异，不能简单地认为是某个特定时间段的生态条件起决定作用[14]。因此，独特的气候资源配置才是特征香气成分合成和积累的真正的生态成因。灰色关联度分析是分析自变量子集和应变量母集中变量的同步变化程度的统计方法，常用来寻找自变量序列中隐藏的时间序列的变化匹配度[15]。

通过对54个生态指标和3个特征香气成分指标的初值化，计算所有差值绝对值的均值(△v)及最大值(△max)，结果表明△max>3△v，说明生态数据序列存在很强的干扰。为避免观测序列的异常值支配整个系统取值，使关联度更好地体现系统的整体性，根据分辨系数(ρ)的取值规则，应选择ρ=1.5×△v/△max，得到整体性灰色关联度合适的分辨系数为0.25。在此基础上，采用数据标准化，计算各生态指标的关联度。关联度越大表示变化趋势越一致，通常以关联度大于0.8的自变量作为主要的影响因素。主要生态因素及其关联度见表3。

表3 龙岩烤烟特征香气成分与生态要素的关联度分析

X4：还苗伸根期降雨量；X8：团棵前期降雨量；X11：团棵中期相对湿度；X36：下部叶成熟期降雨量

X4：Rainfall in seedling restitution and root spreading stage;X8：Rainfall in early rosette stage;X11：Relative humidity in middle rosette stage;X36：Rainfall in maturity of lower leaves

关联度分析表明，影响龙岩特征香气成分的生态因素主要是气象因素，以下部叶成熟期降雨量及还苗伸根期至团棵前期降雨量的关联度较大。结合主成分回归确定各生态指标与特征香气成分的回归关系(表3)，结果表明，特征香气成分含量与下部叶成熟期降雨量及还苗伸根期至团棵前期的降雨量呈动态变化呈密切正相关关系。

X4：还苗伸根期降雨量;X8：团棵前期降雨量;X11：团棵中期相对湿度;X36：下部叶成熟期降雨量X4：Rainfall in seedling restitution and root spreading stage;X8：Rainfall in early rosette stage;X11：Relative humidity in middle rosette stage;X36：Rainfall in maturity of lower leaves图3 龙岩与大理关键生态影响因子的差异Fig.3 The key ecological factors differences between Longyan and Dali

从图3可见，还苗伸根期和团棵前期降雨量表现龙岩明显高于大理，但无显著差异，说明旬尺度上的降雨量变化年际间差异较大，以旬尺度上的数据变化很难解释龙岩特征香气成分的生态成因。然而，中部叶全生育期降雨量的时空变化最终促进了特征香气成分前体物的合成积累。团棵中期相对湿度与降雨量密切相关，团棵后期至打顶期降雨量的影响关联度低于0.8，说明团棵中期至打顶期的各旬降雨量影响较小，但存在累加效应。因此，降雨量的时空分布是龙岩特征香气成分前体物合成积累的关键生态因素，其中下部叶成熟期和还苗伸根期至团棵前期的影响较大。

3 讨论与结论

类胡萝卜素是烟叶中重要的香气前体物，β-大马酮的前体物是β-胡萝卜素、叶黄素和新叶黄素，β-二氢大马酮的前体物是β-胡萝卜素，氧化异佛尔酮的前体物是叶黄素[4]。β-大马酮和β-二氢大马酮洋溢着天然的甜香感，常用于调制玫瑰香、花香、木香、醛香、药草香和果香香调，一般在清香型烟叶中含量较高[16-17]；氧化异佛尔酮香气较为持久，有微酸蜜甜的木香和干果香，对烟草产品具有显著的加香效果[18]。前人[1,19]研究表明，香型及香气量还与香气成分的组成、含量、比例及相互作用密切相关，其中β-大马酮、β-二氢大马酮和氧化异佛尔酮在清香型烟叶中普遍含量较高。逄涛等[20]、周芳芳等[21]研究认为福建烟叶β-大马酮含量较高，而β-二氢大马酮和氧化异佛尔酮区域间差异不显著。本研究β-大马酮、β-二氢大马酮和氧化异佛尔酮在龙岩烟叶中均高于大理烟叶，这可能与取样年份不同及取样点的分布有关[3]。可见，β-大马酮的规律是一致的，均表现为龙岩烟区含量较高。β-二氢大马酮和氧化异佛尔酮在福建和云南的表现规律不尽相同，但表征了清香型烟叶中类胡萝卜素降解的代谢强度及转化生成β-大马酮的强度。综合可见，β-大马酮、β-二氢大马酮和氧化异佛尔酮是龙岩特征香气成分，而β-大马酮是龙岩烟区最重要的特征香气成分。

生态决定烟叶特色，目前，香气成分与生态因子关系的研究很多，主要集中在某一特定地区的单一气候因子与烤烟香气物质之间关系的研究[22-24]，而鲜有对不同区域气候因子的进一步比较分析[25]，更忽略了气候因子影响具有的时间序列累加效应[11,26]，从而导致信息失真。本研究通过对生态因子的比较及其与龙岩特征香气成分的灰色关联度分析，结果表明，影响龙岩特征香气成分的生态因素主要是气象因素，其中降雨量的时空分布是影响龙岩特征香气成分前体物合成积累的关键生态因素，其中下部叶成熟期和还苗伸根期至团棵前期的影响较大，结果很好地与生产实际相吻合。

光对类胡萝卜素生物合成和积累的影响较大，红光和蓝紫光均促进类胡萝卜素的生物合成与积累[27]。类胡萝卜素通常与脂蛋白复合体结合在一起[28]，在硝酸盐充足的条件下可增加类胡萝卜素的产量[29]。烟草中含有大量的β-胡萝卜素[30]，在光照不强烈时，低碳氮比有利于类胡萝卜素的合成[31-32]，而在光照强烈时，高碳氮比有利于类胡萝卜素的合成积累[33]。龙岩烟区雨日多、雨量较大，红光比例较高[34]，整个生育期碳氮比较大理偏低[35]，因此，成熟期之前龙岩烟区碳氮比偏低，红光比例较高，有利于类胡萝卜素的合成，而成熟期大理烟区光照强度较强，蓝紫光比例较高，有利于类胡萝卜素的合成，这可能是类胡萝卜素降解产物β-大马酮、β-二氢大马酮和氧化异佛尔酮含量在龙岩和大理烟区间差异的重要原因。本研究中采集的生态数据因无太阳光谱特征和光强数据，深入分析龙岩特征香气成分的生态成因机制还需采集和积累大量生态资料进一步研究。

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