阻断巨噬细胞介导的PD1/PD-L1通路对小鼠结核复发的抑制作用

孙萌萌，秦 川，唐 军，占玲俊

(中国医学科学院医学实验动物研究所，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，卫计委人类疾病比较医学重点实验室, 新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室，北京市人类重大疾病实验动物模型，中国医学科学院结核病中心，北京 100021)

结核病是危害人类健康的重要传染病，根据WHO(World Health Organization，WHO)报告[1]，2015年全球新发结核病(tuberculosis，TB)数量约为1040万例，有140万人死于结核病。我国每年复发肺结核病患者占新发结核病患者的15%～20%，而复治肺结核中发展成耐药结核的比例约为35%～55%[2]。临床上结核治疗后复发和耐药的情况时有发生，导致结核迁延不愈[3]是耐药结核产生的主要原因，因而控制结核病的疫情首要任务就是要积极预防结核病的复发。

PD1/PD-L1通路在某些病毒和细菌感染中[4-7]发挥作用，PD-1: PD-L1 /PD-L2通路在肿瘤和某些感染性疾病中发挥免疫抑制作用，而在结核病中的免疫作用尚不明确。已有报道[8-10]，菌株BCG(Bacillus Calmette-Guérin)和菌株H37Rv(结核分枝杆菌标准株H37RV)感染PD-1敲除小鼠的相关体内实验显示出PD-1/PD-L1通路相悖的结果。

本研究拟用PD-L1单抗或与异烟肼共同作用探究其对于TNF-α抗体诱导的结核复发的抑制作用。通过分析小鼠结核病急性感染期和复发期的荷菌量及病理病变，明确PD-L1抗体的作用。通过siRNA体外敲低结核菌感染的巨噬细胞上PD-L1或用PD-L1抗体阻断PD1/PD-L1通路，用流式方法检测巨噬细胞凋亡的情况，初步探究巨噬细胞上PD1/PD-L1通路在结核发病和复发中的作用及机制，以期能为结核病复发的临床干预提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株和细胞结核分枝杆菌标准株H37Rv(菌号为93009)由中国药品生物制品检定所提供，在中性罗氏培养管中培养，37℃、5% CO2，培养4周后收菌，无菌过滤制成单细胞悬液，分装储存于-80℃低温冰箱。过滤之后的菌液用细菌超声分散计数仪分散均匀，浓度调为1.0×107CFU/mL。

RAW264.7细胞系购自赛百慷公司。培养于含10%胎牛血清、100 μmol/mL青霉素和100 μmol/mL链霉素的DMEM培养液中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，调节细胞的传代浓度，每2 d传代一次。

1.2 实验动物

SPF级C57BL/6雌性小鼠28只，4～6周龄，体重12～14 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0011]，[SYXK(京)2011-0022]。实验动物的使用得到了中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用和管理委员会的批准(批准号：ZLJ16001)，实验在中国医学科学院医学实验动物研究所生物安全3级实验室(国卫ABSL3-059)进行。动物在感染1周前进入生物安全3级实验室适应。

1.3 主要试剂与仪器

分枝杆菌中性罗氏培养管(珠海贝索生物技术有限公司，中国)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒 (BD公司，美国)；Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒 (BD公司，美国)；LEAFTMPurified Anti-Mouse CD274(B7-H1)(Biolegend，美国)；LEAFTMPurified Anti-Mouse TNF-α (Biolegend)、Isoniazid (Sigma，美国)；CD274 (B7-H1) PE(eBioscience，美国)；流式细胞仪(BD公司，美国)；NanoZoomer S60明场荧光切片扫描仪(日本)；细菌超声分散计数仪(广东体必康生物科技有限公司，中国)；siRNA(广州锐博，AGAcGuAAGcAGuGuuGAA GATATTTGCTGTCTTTATA)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组

实验分为A组：感染对照组、B组：异烟肼治疗组、C组：异烟肼PD-L1抗体协同治疗组、D组：TNF-α诱导复发组、E组：异烟肼协同PD-L1抗体自然复发组、F组：异烟肼自然复发组。

1.4.2 动物感染和取材

以1.0×107CFU/mL的H37Rv 100 μL/只尾静脉感染C57BL/6小鼠，两周之后分别给予异烟肼(10 mg/kg)，异烟肼联合PD-L1单抗(每只每周50 μg)连续治疗四周，之后TNF-α抗体(每只每周50 μg)诱导四周。每个时间点各组分别取4只小鼠脱颈椎处死，解剖取脾脏、肺脏、肝脏组织进行荷菌量的检测和病理分析。

1.4.3 组织荷菌量检测

取左侧肺组织、脾头1/3及肝腹背部的小叶，组织研磨匀浆。匀浆液用生理盐水按照1:10的比例进行梯度稀释，分别取10-1、10-2、10-3三个稀释度的组织稀释液50 μL，接种于分枝杆菌中性罗氏培养管，每个梯度各接种2管，37℃、5% CO2，培养3～4周进行菌落计数。

1.4.4 组织病理分析

余下的脾、肺、肝组织置于4%中性甲醛固定液中固定72 h，脾脏和肝脏组织分别按长轴最大横切面进行修块，肺组织完整分离小肺叶。组织块经梯度酒精脱水后石蜡包埋，切片厚度为5 μm，HE染色之后，将HE片用NanoZoomer S60明场荧光切片扫描仪(日本)进行明场半自动扫片，用VDP.View 2软件对病变组织进行定量分析。分析单位面积(mm2)的肺组织中肉芽肿面积，单位面积(mm2)脾脏内白髓内肉芽肿的面积，单位面积(mm2)肝脏内肉芽肿个数。

1.4.5 PD-L1表达的检测方法

用6孔板每孔加2 mL的5×105cells的巨噬细胞悬液，按照MOI=1加1×106CFU的H37Rv，5% CO2、37℃孵育感染24 h，设置正常对照组和感染组。培养结束后，弃培养液，加入PBS，1000 r/min离心5 min洗涤细胞3遍。收集细胞于1.5 mL离心管中，加200 μLPBS重悬，加PE-PD-L1(eBioscience)流式抗体每孔2 μL，室温避光孵育15 min，标记细胞。上机前100 μL 4%多聚甲醛固定15 min，用流式细胞仪检测细胞PD-L1的表达情况。

1.4.6 PD-L1对巨噬细胞凋亡的影响

感染当天，取对数生长期的RAW264.7细胞1×106个接种到六孔板，于5% CO2、37℃、饱和湿度条件下培养，共3个组：对照组control、实验组H37RV、PD-L1+H37Rv，每个处理组设3个复孔。第二天加入PD-L1-siRNA或PD-L1抗体，孵育1 h之后加入H37Rv感染巨噬细胞，培养4 h后消化细胞并收集细胞，加入PBS 1000 r/min离心5 min洗涤后，将细胞重悬于400 μL 1×binding buffer(BD Pharmingen PE annexin V apoptosis detection kit I，LOT:7026588)中。PD-L1-siRNA组加入5 μL FITC Annexin V和5 μL propidium iodide staining solution(PI)染色；PD-L1单抗组加入5 μL PE annexin V和5 μL7-AAD染色。室温避光孵育15 min，加400 μL 1 × binding buffer到每个管中。每管加4%多聚甲醛200 μL固定15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠组织荷菌量分析

小鼠在感染2周后分别给予异烟肼和异烟肼联合PD-L1进行治疗4周后(图1)相比较A组，B, C组肺、脾、肝脏荷菌量明显减少(P<0.001)，C组较之B组荷菌量虽有下降，但是差异无显著性。B和C组的小鼠用TNF-α抗体诱导四周后(图1)，相比较F组，D组肺、脾、肝荷菌量明显增加(P<0.01、P<0.001、P<0.001)；E组的肝脏和脾脏的荷菌量减少，但是差异无显著性。与D组相比，E组肝脏和脾脏荷菌量显著性减少(P<0.001)。

注：1：肺脏荷菌量；2：脾脏荷菌量；3：肝脏荷菌量；A:感染对照组；B：异烟肼治疗组；C：异烟肼PD-L1抗体协同治疗组；D：TNF-α诱导复发组；E:异烟肼协同PD-L1抗体自然复发组；F:异烟肼自然复发组；与A组比较，***P< 0.001；与D组比较，##P< 0.01，###P< 0.001。图1 小鼠结核模型中肺脾肝不同时期的菌荷菌量(n=4)Note.1: Bacterial load in lung. 2: Bacterial load in spleen.3: Bacterial load in liver.A: infection group. B:isoniazid treatment group.C：isoniazid combined with PD-L1 monoclonal antibody group. D: TNF-α induced-relapse group. E: natural relapse inisoniazid combined PD-L1 monoclonal antibody group.F: natural relapse in isoniazid group. Compared with the group A,***P< 0.001.Compared with the group D，##P< 0.01,###P< 0.001.Fig.1 Bacterial load of the lung, spleen and liver in the M. tuberculosis-infected mice in different periods

2.2 感染小鼠组织病理变化

感染2周治疗4周之后(图3)，A组肝脏病变主要为出现大量散在的小肉芽肿，肉芽肿主要由巨噬细胞、淋巴细胞及少数中性粒细胞构成。脾脏白髓区及红髓区可见主要由巨噬细胞组成的肉芽肿。肺脏可见肉芽肿样病变。病理定量分析(图2)，相比较于A组B、C组的脾脏病变明显减轻(P<0.01)，肝脾病变显著减轻(P<0.01，P<0.001)(图2)，但是A组和B组的肝脾病理差异无显著性。TNF-α抗体诱导四周之后(图2)，D、E组肝脏、脾脏和肺脏内均可见的肉芽肿，但是E组的脾脏肉芽肿要比D组的病变面积小。进行病理病变定量分析(图2)，相比较D组，E组的肺脾的病变程度显著性减轻(P<0.01、P<0.05)，肝脏的肉芽肿密度也显著降低(P<0.01)，相对于F组，E组的肺脏和肝脏的病变程度降低，但是二者差异没有显著性。

注：1：肺脏荷菌量；2: 脾脏荷菌量；3: 肝脏荷菌量；A: 感染对照组；B: 异烟肼治疗组；C:异烟肼PD-L1抗体协同治疗组；D: TNF-α诱导复发组；E: 异烟肼协同PD-L1抗体自然复发组；F: 异烟肼自然复发组；与A组比较，***P<0.001, **P<0.01; 与D组比较，#P<0.05, ##P<0.01。图2 小鼠结核模型中肺脾肝不同时期的组织病变定量(n=4)Note.1: Bacterial load in lung.2: Bacterial load in spleen.3: Bacterial load in liver.A: Infection group. B: Isoniazid treatment group.C: Isoniazid combined with PD-L1 monoclonal antibody group. D: TNF-α induced-relapse group.E: Natural relapse inisoniazid combined with PD-L1 monoclonal antibody group.F: Natural relapse in isoniazid group. Compared with the group A,***P< 0.001, **P< 0.01. Compared with the group D, #P< 0.05, ##P< 0.01.Fig.2 Quantitative analysis of the pathological changes in the lung, spleen and liver tissues of the M. tuberculosis-infected mice in different periods

2.3 结核菌感染巨噬细胞后PD-L1的表达

流式细胞仪检测发现(见图4)：H37Rv感染巨噬细胞24 h后，红色峰(感染组)相比较蓝色峰(对照组)右移，表明PD-L1表达升高。

2.4 PD-L1敲低或阻断后对结核菌感染的巨噬细胞凋亡的影响

利用流式细胞仪检测结核菌感染的巨噬细胞的凋亡，用PD-L1单抗干预后，巨噬细胞对照凋亡率为见(图5A)左图(14.4%)，H37Rv感染后巨噬细胞凋亡率见中图(12.2%)，加入PD-L1单抗后，巨噬细胞凋亡的细胞比例见右图(13.9%)。对3个复孔流式结果进行统计，结果见图5 A-1， H37Rv感染巨噬细胞之后细胞凋亡率降低(P< 0.05)，加PD-L1单抗后细胞凋亡率较感染组显著性上升(P< 0.05)。

用siRNA敲低巨噬细胞上PD-L1后检测细胞凋亡(图5B)，左图为巨噬细胞对照(14.4%)，中图为H37Rv感染巨噬细胞后凋亡情况(7.97%)，右图为H37Rv感染后加入PD-L1-siRNA后，凋亡的细胞比例(14.0%)。对3个复孔流式结果进行统计(图5B-1)，H37Rv感染巨噬细胞之后细胞凋亡率显著性降低(P< 0.001)，加PD-L1-siRNA组细胞凋亡率较感染组显著性上升(P< 0.001)。

3 讨论

本研究发现，结核急性感染经过异烟肼单独治疗及PD-L1单抗协同异烟肼治疗后，均可以明显降低荷菌量和减轻病变，虽然两者组间无显著性差异，但是经TNF-α抗体诱导复发之后，可以看到PD-L1单抗联合异烟肼治疗组相比较单用异烟肼治疗组，可以显著降低复发期的荷菌量和病变。这表明PD-1：PD-L1通路在体内可能发挥免疫抑制作用，PD-L1单抗阻断PD-1:PD-L1通路后，可能逆转该通路的免疫抑制作用，从而遏制复发期荷菌量上升而表现出免疫保护作用。用H37Rv体外感染巨噬细胞，24 h后发现PD-L1的表达上升，利用PD-L1抗体阻断或si-RNA敲低结核菌感染的巨噬细胞上PD-L1，可以促进巨噬细胞的凋亡，在抑制小鼠结核的复发中发挥作用。

上述结果与已发表的用BCG感染PD-1敲除小鼠的结论是一致的，但是与H37Rv感染的PD-1敲除小鼠的结论是相悖。但依然不能否认结核感染的宿主体内PD1/PD-L1通路发挥免疫抑制作用。究其原因，是因为：其一：用BCG和H37Rv分别感染小鼠后，PD-1通路所发挥的免疫作用不同，这种差异的产生可能与PD-L1、PD-L2的差异表达有关。小鼠感染BCG后，PD-L1高表达，而PD-L2无明显表达变化。PD-1:PD-L1通路使Th1型细胞免疫功能受到损伤，可以恢复Th1型细胞免疫的功能，从而在体内表现出免疫保护作用，即PD-1敲除后的小鼠脾脏荷菌量比野生型小鼠低。H37Rv感染小鼠后，PD-L1和PD-L2均出现高表达，可能是因为PD-1：PD-L1和PD-1：PD-L2发挥相反的作用，即PD-1：PD-L1发挥免疫抑制作用，PD-1：PD-L2发挥免疫保护作用。其二∶PD-L1和PD-1免疫功能抑制作用的机制不尽相同。在肿瘤和多种慢性感染中[11]，PD-1通过与PD-L1、PD-L2结合，从而抑制T细胞的TCR信号，进一步下调免疫激活因子和与存活相关的蛋白表达。而在APC上表达的PD-L1存在于MASK/细胞因子/STAT-3依赖模式中∶在STAT-3的调控下，TLR-APC在IL-6和IL-10上高表达，同时抑制STAT-3活化，进而阻断PD-L1的表达。所以，在阻断PD-1和PD-L1后免疫反应存在一定的差异。

而PD：PD-L1通路的体外结果与本研究组PD-L1抗体干预的结果一致，虽然已报道的PD-1敲除小鼠结果与之相左，依然提示小鼠体内PD1：PD-L1通路可能发挥免疫抑制 作用，其原因是因为PD-1敲除小鼠可能由于敲除导致的自身免疫过强使结核加重，然而，其精确作用和机制需要深入研究。

注：从左到右分别为脾、肝、肺的组织病变图；HE染色:大图是×12.5倍，左上角小图为×100倍；脾、肝和肺组织中标记处为病变。图3 小鼠结核模型中肺脾肝不同时期的组织病理改变(n=4)Note.Figures from left to right stand for pathological changes in the spleen, liver and lung tissues, respectively, HE staining. Magnification was ×12.5 of the larger picture, ×100 of the upper left insets. The markers on the spleen, liver and lung tissue pictures are the disease lesions.Fig.3 Pathological changes in the lung, spleen and liver tissues in the M. tuberculosis-infected mice in different periods

注：A为巨噬细胞阴性对照；B为H37Rv感染巨噬细胞24 h的结果；红色峰表示感染细胞PD-L1的表达；蓝色峰表示未感染细胞PD-L1的表达。图4 感染H37Rv的巨噬细胞PD-L1的表达Note.A stands for negative control macrophages. B stands for the result of macrophages H37Rv-infected for 24 hours.Red curve represents the expression of PD-L1 of infected macrophages.Blue curve represents the expression of PD-L1 of uninfected macrophages.Fig.4 PD-L1 expression of the macrophages infected by H37Rv

注：与Control组比较，*P< 0.05,***P< 0.001；与H37Rv组相比较， #P< 0.05,###P< 0.001。图5 PD-L1对感染的巨噬细胞的凋亡影响(n=3)Note.Compared with the control group， *P<0.05,***P<0.001. Compared with the H37Rv group， #P< 0.05, ###P< 0.001.Fig.5 Effect of PD-L1 on apoptosis in the infected macrophages

巨噬细胞作为机体天然免疫系统中重要的效应细胞，其细胞凋亡作为一种有利于宿主清除结核菌的方式，及通过防止结核菌逸散造成二次感染[12]，在机体与结核杆菌的抗争中起着非常重要的作用。体外实验发现，敲低PD-L1或用抗体阻断均可以逆转结核感染中PD1：PD-L1通路对巨噬细胞凋亡的可能抑制作用，有效促进结核菌的清除并防止结核菌逸散造成的二次感染，即抑制结核病的复发。该作用需要在细胞上PD-L1特异性敲除的小鼠中深入论证。

综上所述，阻断PD1:PD-L1通路可以抑制结核病的复发，该抑制作用与促进巨噬细胞凋亡有关。

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