AFB1与吸附剂对牦牛瘤胃发酵性能的影响

李子谦，文勇立*，齐沛森，安雅静，李 铸，艾 鷖，赵佳琦，李 强，安德科

(1.西南民族大学青藏高原研究院，成都 610041；2.四川省畜牧总站，成都 610041；3.金川县畜牧兽医服务中心，四川 金川 624100)

牦牛分布于我国青藏高原，我国占世界总量90%以上，是当地重要生产生活资料及地方经济发展支柱。传统牦牛饲养依靠纯天然放牧，生产方式落后，经济效益较低。随生产方式改进，逐渐开展牦牛舍饲、半舍饲养殖。但牦牛饲料易受霉菌毒素污染，影响健康和产品安全。因此，研究霉菌毒素对牦牛瘤胃发酵影响利于牦牛产业发展。我国部分地区饲料及原料黄曲霉毒素B1（Aflatoxins B1，AFB1）含量达11.2 μg·kg-1，粕类达47.6 μg·kg-1[1]。一般选择酵母细胞壁提取物（Yeast cell wall extract，YCW）和蒙脱石（Montmorillonite，MMT）作霉菌毒素脱毒剂。YCW结构中β-葡聚糖（β-glucan）是吸附活性成分，可与霉菌毒素分子相互作用结合排出体外[2-3]。YCW中甘露寡糖（Mannan-oligosaccha⁃rides，MOS）可促进瘤胃有益菌增殖[4-6]。MMT在干燥条件下与AFB1间主要以离子偶极相互作用或交换阳离子/羰基氧配位结合，湿润条件下主要以交换阳离子水化膜和羰基间形成氢键结合[7]。Seeling等对体外瘤胃微生物静态培养表明，随AFB1浓度增加，氨氮（NH3-H）、挥发性脂肪酸（VFA）浓度及甲烷产量下降，且抑制羧甲基纤维素酶和微晶纤维素酶活性[8-10]。除pH、NH3-H、VFA等外，微量元素通过影响瘤胃微生物代谢与发酵性能关系密切[11]。有关吸附剂及AFB1对微量元素影响，朱金林等研究表明，不同吸附剂对微量元素具有不同程度吸附作用，仅见硒（Se）对其AFB1毒性具有缓解作用[12-14]。目前研究多基于体外试验，涉及瘤胃氨氮（NH3-H）、挥发性脂肪酸（VFA）及纤维素酶活性等报道较少[15]。另外，Kutz等吸附剂研究表明，水合铝硅酸钙钠（HSCAS）可降低乳中黄曲霉毒素M1（Aflatoxins M1，AFM1）转化率，YCW物可降低机体对AFB1吸收[16-17]。本研究以牦牛为试验对象，在饲料中添加不同水平AFB1及3种吸附剂处理：MMT、YCW、MMT+YCW，分析AFB1和吸附剂对牦牛瘤胃发酵性能影响。旨为AFB1影响瘤胃性能相关研究积累资料，为反刍动物饲料安全和吸附剂应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

主要仪器：pH计8362sc(购自美国哈希公司)；漩涡振荡器XH-B（购自上海汗诺仪器有限公司）；紫外可见分光光度计UV-9000S（购自上海元析仪器有限公司）；气相色谱仪LC-20A（购自日本岛津仪器公司）；超声波细胞破碎仪JY92-IIN（购自宁波新芝生物科技股份有限公司）；恒温水浴摇床WHY-2A（购自常州市华怡仪器制造有限公司）；iCAP6000全谱直读型台式ICP光谱仪（购自美国Thermo Fisher Scientific Inc.公司）。

主要试剂：AFB1标准品（99.5%），购自以色列FERMENTEK公司；蒙脱石（＞95%），购自赤峰和明生化有限公司；酵母细胞壁提取物（甘露寡糖≥20%），购自安琪酵母股份有限公司；L-乳酸（≥98%）、偏磷酸（≥98%）、对羟基联苯（≥99%）、微晶纤维素（≥99%）、羧甲基纤维素钠（≥99%）、水杨苷（≥98%）、木聚糖（≥95%）、浓硝酸（≥68%）等，购自上海瀚思化工有限公司。

1.2 动物分组与处理

2017年9月在四川省阿坝藏族羌族自治州茂县茂兴牦牛养殖场选择16头健康、发育正常，36月龄公牦牛，平均体重为195.8 kg。试验牦牛饲养管理条件一致，自由采食和饮水。日粮精粗比1∶4，精料为豆粕（40%）和玉米粉（60%）。试验采用2因素4水平完全正交试验设计法（见表1），对AFB1与吸附剂处理作主效应方差分析，AFB1水平：A（20 μg·kg-1）、B（40 μg·kg-1），C（60 μg·kg-1）、对照组，吸附剂处理：Ⅰ（MMT 50 g·头-1·d-1）、Ⅱ（YCW 50 g·头-1·d-1）、Ⅲ（MMT 25 g·头-1·d-1+YCW 25 g·头-1·d-1）、对照组。投喂7 d。每天6:00，18:00两次饲喂。每日6:00先将AFB1和吸附剂掺入一小撮精料中，混匀，待牦牛全部采食后，投喂剩余饲料。

表1 2因素4水平完全正交试验设计Table 1 Two factors and four levels complete orthogonal design

1.3 样品采集与制备

于第8天采集瘤胃液，饲喂后2 h，用负压采集器，经导管通过口腔食道，深入到瘤胃内中部，为防止唾液污染，弃去前一部分，采集瘤胃液约100 mL。一部分样品经过4层纱布过滤，立即测定pH，分装-72°C保存，用于NH3-N、VFA浓度测定；另一部分样品不过滤，直接分装-72°C保存，用于微生物蛋白（MCP）、纤维素酶活性（微晶纤维素酶、羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶和木聚糖酶）测定。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 瘤胃发酵性能指标测定

优化对羟基联苯法定量测定乳酸浓度，参照文献[18]；比色法测定NH3-N浓度，参照文献[19]；气相色谱法外标法测定VFA浓度，嘌呤法测定MCP浓度，参照文献[20]；纤维降解酶活性测定参照文献[21]。

1.4.2 瘤胃液微量元素的测定

取过滤瘤胃液5 mL于洁净三角瓶中，加入约100 mL浓硝酸。先将电热板温度调至200℃低温消解，待达到硝酸分解温度后，将电热板升温至400℃。加热期间瓶中液体低于20 mL时，可加入适量浓硝酸。待瓶内液体澄清，所剩液体约5 mL时，取下冷却，用10%硝酸于10 mL定容管中定容，收集滤液测定ICP-OES。

1.5 数据处理

用SPSS作2因素4水平方差分析，估计因子效应，用LSD作行多重比较。结果采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 AFB1对瘤胃发酵性能影响

由表2可知，AFB1显著降低瘤胃pH、NH3-H、总VFA、乙酸、丙酸戊酸浓度、微晶纤维素酶、纤维二糖酶、木聚糖酶活性（P＜0.01或P＜0.05）。丁酸、MCP、乳酸浓度浓度、羧甲基纤维素酶活性随AFB1浓度升高而降低（P＞0.05）。AFB1在60 μg·kg-1水平下，纤维二糖酶活性显著低于对照组（P＜0.05），表明当 AFB1浓度达 60 μg·kg-1时，对该指标影响具有统计学意义，为最低危害浓度；在40、60 μg·kg-1水平下，木聚糖酶活性显著低于对照组（P＜0.05），表明当AFB1浓度达到40 μg·kg-1时，对该指标影响具有统计学意义，为最低危害浓度。

2.2 AFB1对瘤胃液微量元素含量影响

由表3可知，随AFB1水平升高，瘤胃液Fe、Cu、Zn、Mn、Se含量极显著或显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。

表2 AFB1对瘤胃发酵性能影响Table 2 Effect of AFB1 on the rumen fermentation performance

表3 AFB1对微量元素影响Table 3 Effect of AFB1 on trace elements (mg·L-1)

2.3 吸附剂对瘤胃发酵性能影响

由表4可知，3种吸附剂处理均不同程度降低乙丙比和提高总VFA、乙酸、丙酸、丁酸MCP浓度、羧甲基纤维素酶活性，效应顺序为Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅰ，但仅见YCW具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。

混合处理组（MMT+YCW）效果大于对照组和MMT组，但小于YCW组。

2.4 吸附剂对瘤胃液微量元素影响

由表5可知，3种吸附剂处理均不同程度降低Fe、Cu、Zn、Mn、Se含量（P＞0.05），其降低程度由高到低为Ⅰ＞Ⅲ＞Ⅱ。

表4 吸附剂对瘤胃发酵性能影响Table 4 Effects of adsorbents on the rumen fermentation performance

表5 吸附剂对微量元素影响Table 5 Effects of adsorbents on trace elements(mg·L-1)

3 讨 论

3.1 AFB1对瘤胃发酵性能影响

对照组pH为6.25，处于正常范围[22]。处理组为5.51～5.83。Mould等研究指出，当pH≤6.0时，纤维降解菌活性完全受抑制[23]。显示牦牛瘤胃纤维降解受AFB1影响。齐琪基于瘤胃微生物体外培养，发现AFB1对羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶和纤维分解菌酶活性有抑制作用[10]。本研究结果与体外试验报道结果一致，表明AFB1降低牦牛瘤胃pH同时影响瘤胃纤维降解作用。对照组NH3-H浓度为8.96 mg·dL-1，处于正常范围，处理组为6.77～7.22 mg·dL-1，低于正常范围[24]。由于NH3-H浓度与蛋白利用率有关，表明AFB1影响牦牛蛋白利用率。Dengler等VFA转运的分子机制研究认为，VFA与组织新陈代谢有关[25]，Jiang等通过瘤胃微生物体外静态培养，发现AFB1浓度升高，总VFA、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸浓度下降[26]，本试验结果与其相符，因此验证体内试验与体外试验结果一致，显示牦牛新陈代谢受到AFB1抑制。Mojtahedi等通过体外发酵试验，发现在含有AFB1培养基中，干物质消化率显著降低[27-28]。Burmeister等采用主要成分为AFB1的霉菌毒素（AFs）粗提物，研究微生物对该粗提物敏感性，发现与MCP合成相关芽孢杆菌、梭菌和链霉菌受抑制[29]，与本研究AFB1影响MCP结果一致。目前未见AFB1对瘤胃乳酸浓度影响报道，但瘤胃乳酸浓度过高可引起动物急性酸中毒，还可导致动物出现瘤胃炎和肝水肿等疾病[30-32]。本研究发现AFB1影响乳酸代谢，可能引起牦牛酸中毒或发生瘤胃及肝脏疾病风险。目前未见AFB1对微量元素影响相关研究，Se可以降低AFB1对动物毒性，但作用机制尚不明确[13-14]。本研究AFB1降低瘤胃液Se、Fe、Cu、Zn、Mn含量（P＞0.05），推测Se等微量元素与AFB1存在与吸附剂类似结合作用，可能在动物体内与AFB1结合排出体外，降低瘤胃液中微量元素含量。

3.2 吸附剂对发酵性能影响

本研究通过测定瘤胃发酵性能等相关指标分析MMT和YCW对AFB1吸附效果，表明两种吸附剂具有较好作用。MMT属硅铝酸盐类吸附剂，可以吸水膨胀形成触变凝胶体，具有离子交换能力，且可以调节瘤胃微生物发酵。在饲料中添加硅铝酸盐类钠基膨润土，可使总VFA浓度升高[33-35]。本研究MMT提高总VFA浓度与其吸附作用和对瘤胃微生物调节作用有关。针对YCW吸附作用研究，Ehrlich等认为特殊键结方式和分子氢键使YCW中β-葡聚糖呈螺旋结构可与多种霉菌毒素形成互补构造，通过肠道排出动物体外[35-37]。同时，YCW中甘露寡糖（MOS）具有改善瘤胃菌群结构和内环境功能作用。陈志龙等研究表明，日粮中添加MOS显著提高瘤胃中原虫、真菌数量，提高VFA、MCP浓度[5-6]。本研究显示YCW效果优于MMT，可能因YCW在吸附AFB1同时，叠加其结构中MOS对瘤胃菌群结构有益生理效应。朱金林等研究表明，吸附剂可以吸附Cu、Fe、Mn、Zn等微量元素，其中无机类吸附剂吸附效果显著高于有机类[12]。本研究3种吸附剂处理均降低微量元素含量，且MMT效应大于YCW，吸附剂虽可抑制AFB1毒性，同时也吸附动物所需微量元素，影响机体对微量元素利用。因此，生产上应用吸附剂的同时，还应考虑补充微量元素。由于YCW对AFB1吸附作用大于MMT，但对微量元素吸附作用小于MMT，说明YCW综合效果较优。

本研究中，当 AFB1 浓度为 20 μg·kg-1时，NH3-H、戊酸浓度及微晶纤维素酶活性差异显著（P＜0.05），因此有必要在20 μg·kg-1以下范围设置浓度梯度试验，确定最低危害浓度。此外，目前尚未见吸附剂最优剂量报道。本研究仅采用产品推荐剂量，应通过两种吸附剂浓度梯度试验确定MMT与YCW最优剂量；MMT+YCW处理组结果尚不能说明是否存在协同效应，可能与未设置吸附剂浓度梯度有关。

4 结论

AFB1对牦牛瘤胃发酵具有负面影响，且浓度越高，影响越大；AFB1可降低瘤胃液微量元素含量；3种吸附剂处理均可抑制AFB1对牦牛瘤胃微生物毒性，其中YCW效果较优。

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