婴幼儿配方谷粉中多组分反式脂肪酸的同步测定

黄 丽

李金林1，2

王楚芳1

万 亮1，2

(1.南昌市食品药品检验所，江西 南昌 330038；2.南昌市食品安全检测与控制重点实验室，江西 南昌 330038)

婴幼儿配方谷粉是婴幼儿重要的辅助食品，与婴幼儿的健康息息相关。反式脂肪酸(TFAs)是指分子中含有一个或多个反式双键的非共轭不饱和脂肪酸的总称[1]。研究[2-4]表明，TFAs会对婴幼儿中枢神经的发育产生不良影响，还能引起婴幼儿向心性肥胖和高血脂症，并对学习认知和记忆造成损害。2010年中国卫生部发布的《婴幼儿主辅食类的食品安全国家标准》中明确规定了原料“不应使用氢化油脂”[5-7]。

目前反式脂肪酸检测分析方法主要有气相色谱法[8-9]、基于银离子的色谱分析法[10-12]、红外光谱吸收法[13-14]以及毛细管电泳法[15-16]等，其中气相色谱法因分离准确、稳定性好被广泛应用，但目前未见对婴幼儿配方谷粉中TFAs组分的研究报道。GB 5413.36—2010测定婴幼儿配方食品中TFAs总量仅包括C18:1T和C18:2T2种TFAs之和，但实际样品中TFAs组分复杂多样。本研究通过对气相色谱-质谱条件的优化，建立了多组分TFAs的同步测定方法；应用该方法对婴幼儿配方谷粉中的TFAs进行组分鉴定和含量测定，为婴幼儿配方谷粉中TFAs的风险评估提供基础数据，也为婴幼儿配方谷粉企业科学生产、工艺改进提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

α-亚麻酸8种同分异构体混标(C18:3-9T,12T,15T、C18:3-9C,12T,15T、C18:3-9T,12C,15T、C18:3-9T,12T,15C、C18:3-9C,12C,15T、C18:3-9C,12T,15C、C18:3-9T,12C,15C、C18:3-9C,12C,15C)、13组分TFAs甲酯混标[C14:1(9T)、C15:1(10T)、C16:1(9T)、C17:1(10T)、C18:1(6T)、C18:1(9T)、C18:1(11T)、C18:2(9T、12T)、C19:1(10T)、C19:1(7T)、C20:1(11T)、C22:1(13T)、C18:1-12羟基-(9T)]：上海安谱科学仪器有限公司；

其他试剂按GB 5413.36—2010准备；

1.1.2 主要仪器设备

气相色谱-质谱联用仪：Agilent 7890A/5975C型，配FID检测器、HP-88毛细管石英柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)，安捷伦科技有限公司；

电子天平：AL204型，梅特勒-托利多仪器有限公司；

超声波清洗器：UP5200H型，南京全君达超声电子设备有限公司；

旋转蒸发仪：N-1001型，上海爱朗仪器有限公司；

氮吹仪：QSC-12T型，上海泉岛公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备 试样的前处理、脂肪酸的提取、脂肪酸甲酯的制备按GB 5413.36—2010执行。

1.2.2 多组分TFAs同步测定方法的建立 采用气相色谱-质谱联用法。

(1) 气相色谱条件优化：在GB 5413.36—2010方法基础上，以8种α-亚麻酸同分异构体混标和13组分TFAs甲酯混标为分离对象，在探索被分离对象大致沸点(180～240 ℃)基础上选择较高柱温的程序升温且保持时间更长，使得多种反式脂肪酸及其同分异构体充分分离，建立同步测定多组分TFAs的方法，详细参数设置见表1。其中色谱条件A为本研究优化的色谱条件，分离条件B为GB 5413.36—2010方法的色谱条件。

表1 色谱条件的优化Table 1 Optimization of chromatographic condition

(2) 质谱条件：接口温度280 ℃；EI离子源；离子源温度23 ℃；四级杆温度150 ℃；电子能量70 eV；电子倍增电压1 100 V；溶剂延时14 min；扫描范围35～550 αμm。定量离子：饱和脂肪酸74；不饱和脂肪酸55。

1.2.3 婴幼儿配方谷粉中TFAs的测定和组分鉴定 按照1.2.2建立的方法，以C13:0为内标(浓度5.70 mg/mL)，对16个不同生产厂家不同配方的共38批婴幼儿配方谷粉样品中TFAs进行组分鉴定和含量测定，并对其来源进行分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱分离结果

色谱条件A和B对13组分TFAs甲酯混标、α-亚麻酸8种同分异构体混标分离色谱图见图1、2。

ETCR组采用Chow双切口法[15]，在豌豆骨近极边缘近端0.5cm水平掌长肌腱尺侧1cm处横行切开长约3cm切口，切开皮肤及皮下组织，分离深筋膜暴露腕横韧带近端。保护好正中神经，用表面带有凹槽的关节镜套管纵行插入腕管并指向远端出口。拇指充分外展后尺侧缘的平行线与第3指蹼垂线形成直角，在直角平分线距交点远端1cm即为出口。于该处纵行切开长约1cm 切口，将关节镜套管于此出口处暴露出来。抽出套芯，将凹槽偏向尺侧，用关节镜观察凹槽处暴露光滑呈白色的腕横韧带，同时用弯头的射频汽化刀头由远及近切断腕横韧带。

图1 色谱条件A和B对13组分TFAs甲酯标准品分离色谱图Figure 1 Methyl standard substance chromatogram separation of 13 components of TFAs with chromatographic conditions A and B applied

图2 色谱条件A和B对α-亚麻酸8种同分异构体分离色谱图Figure 2 The separation chromatogram of 8 kinds of α linolenic acid isomers with chromatographic condi-tions A and B applied

由图1可知，在色谱条件A下，13组分TFAs甲酯混标中除C18:1(6T)和C18:1(9T)组分未完全分离外，其余组分完全分离，基线和峰形较好，峰尖清晰可辨。而在色谱条件B下，C18:1(6T)与C18:1(9T)及C19:1(10T)与C19:1(7T)不能实现分离，形成拖尾峰。

由图2可见，2种色谱条件都能将8种α-亚麻酸同分异构体分离，但采用色谱条件A分离的峰形和峰尖明显优于色谱条件B，分离效果更好。因此，本研究优化的色谱条件A对脂肪酸混标及同分异构体混标的分离效果要明显优于色谱条件B的。

色谱条件B测定TFAs总量仅包括C18:T和C18:T2种TFAs之和，用于TFAs甲酯分离程度及定性鉴定的脂肪酸甲酯混标仅包括C18:0、C18:1-T、C18:1-C、C18:2-T,T、C18:2-C,C5种。试验结果表明，在色谱条件B下，多组分的TFAs不能很好地分离。故本研究对升温程序进行了优化，选择较高柱温的程序升温，且保持时间更长，使各组分在近似沸点附近进行活跃洗脱吸附，能将多组分的TFAs基本分离，达到预期分离效果。

色谱条件A下，以相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值计算分离度R，C14:1(9T)、C15:1(10T)、C16:1(9T)、C17:1(10T)、C18:1(6T)、C18:1(9T)、C18:1(11T)、C18:2(9T、12T)、C19:1(10T)、C19:1(7T)、C20:1(11T)、C22:1(13T)和C18:1-12羟基-(9T)之间分离度计算结果依次为33.73，32.66，38.53，33.97，0.50，2.31，20.53，10.46，1.59，33.34，60.56，121.00；C18:3-9T,12T,15T、C18:3-9C,12T,15T、C18:3-9T,12C,15T、C18:3-9T,12T,15C、C18:3-9C,12C,15T、C18:3-9C,12T,15C、C18:3-9T,12C,15C、C18:3-9C,12C,15C之间分离度计算结果依次为5.03，2.16，1.22，2.75，6.60，1.25，4.46。由结果可知，对于13组分的TFAs混标，C18:1-T与C18:1-T两峰分离度为0.5<1.0，两峰几乎重叠，仅峰尖可辨；其他组分之间分离度均>1.5，能完全分离。对于α-亚麻酸8种同分异构体混标，C18:3-9T,12C,15T与C18:3-9T,12T,15C以及C18:3-9C,12T,15C与C18:3-9T,12C,15C分离度分别为1.22和1.25，均介于1.0与1.5之间，分离不完全，但两峰峰尖可辨别，属于基本分离，其余组分之间分离度较好，能完全分离。

2.2 质谱分析结果

根据质谱库检索，参照林麒等[17]研究结果，推测α-亚麻酸8种同分异构体甲酯的出峰顺序见表2。故本研究建立的气相色谱法可作为调查婴幼儿配方谷粉中TFAs的方法。

2.3 婴幼儿配方谷粉中TFAs的检测结果

应用本研究建立的方法检测来自16个生产厂家不同配方的共38批婴幼儿配方谷粉，得出婴幼儿配方谷粉中TFAs平均总含量为0.749 3 mg/g。由图3可知，52.6%的婴幼儿配方谷粉TFAs总含量为0.04～0.5 mg/g，76.3%的婴幼儿配方谷粉TFAs总含量为0.04～1.0 mg/g，92.1%的婴幼儿配方谷粉TFAs总含量为0.04～2.0 mg/g，仅有8%的婴幼儿配方谷粉TFAs总含量≥2.0 mg/g，婴幼儿配方谷粉中TFAs总体含量较低。

表2 α-亚麻酸8种同分异构体的出峰顺序表Table 2 Peak appearance sequence of 8 kinds of α linolenic acid isomers

图3 38批婴幼儿配方谷粉TFAs含量分布Figure 3 Distribution of TFAs content in 38 batches of infant formula farina

不同配方婴幼儿谷粉中TFAs含量分析结果见表3，由表3 可知，平均含量最高的组分依次为C18:1-11T、C19:1-7T、C18:3-9T,12T,15T、C18:1-9T和C18:2-9,12TT。C18:3-9T,12C,15T、C18:3-9T,12C,15C和C18:1-12羟基-9T3种TFAs在所测样品中均未检出，其他TFAs组分含量较低且差异不明显。

从表3还可以看出，粗粮型的谷粉含有的TFAs组分种类单一且含量最低，主要组分为C19:1-7T。当配料中添加含有脂肪酸的配料时，TFAs的含量和组分均增加。当添加DHA、ARA配料时，TFAs主要组分为C18:1-9T、C19:1-10T和C19:1-7T；当添加奶粉、棕榈酸酯、大豆蛋白、螺旋藻、混合蛋白等配料时，TFAs主要组分为C18:1-11T、C19:1-7T和C18:1-9T；配料中添加复合营养素的谷粉中TFAs主要组分为C18:2-9,12TT和C18:3-9T,12T,15T。所测的TFAs含量最高的3个谷粉样品配方中分别添加了螺旋藻、全脂奶粉+大豆分离蛋白+乳清蛋白和复合营养素。螺旋藻型配方谷粉TFAs含量高可能是由于配料螺旋藻中含有大量不饱和脂肪酸[18]所致；奶粉型配方谷粉中TFAs组分测定结果与宋立华等[19]报道牛乳中的天然TFAs的组分也基本一致，因此推断婴幼儿配方谷粉的配料可能对最终产品中反式脂肪酸种类及含量存在影响。婴幼儿配方谷粉中的配方配料对TFAs组分和含量的影响规律尚不清楚，有待进一步研究。

2.4 来源分析

由表3可知，配方配料的带入是婴幼儿配方谷粉中的TFAs来源之一。据文献[20～21]报道婴幼儿配方谷粉中的TFAs大部分是生产过程中高温条件下脂肪酸分解和发生异构化反应产生的。

3 结论

本研究建立的气相色谱-质谱联用法可用于同步测定多组分TFAs，该方法对分析多组分TFAs及其同分异构体具有较好的分离效果。应用该方法测定38批市售婴幼儿配方谷粉中的反式脂肪酸，测得平均含量为0.749 3 mg/g，总体含量较低，主要组分为C18:1-11T、C19:1-7T、C18:3-9T,12T,15T、C18:1-9T和C18:2-9,12TT。婴幼儿配方谷粉中的TFAs与配方配料及生产加工工艺条件相关，故生产过程中应严格控制工艺条件，避免生产过程中不饱和脂肪酸转化为TFAs。婴幼儿配方谷粉中的配方配料对TFAs组分和含量的影响规律以及生产加工过程条件对TFAs组分和含量的影响有待进一步研究。

表3 不同配方婴幼儿配方谷粉的TFAs含量†Table 3 TFAs content in different formulas of infant formula farina mg/g

† 除大米外，粗粮型指配料中添加了粗粮、维生素、矿物质；DHA型指配料中添加了DHA、ARA；奶粉型指配料中添加了乳粉；大豆蛋白型指配料中添加了大豆蛋白；棕榈酸酯型指配料中添加了棕榈酸酯；螺旋藻型指配料中添加了螺旋藻粉；混合蛋白型指配料中添加了全脂奶粉、大豆分离蛋白、乳清蛋白；复合营养素型指配料中添加了复合营养素包。

[1] Food and Drug Administration.Food Labeling: Trans fatty acids in nutrition labeling, nutrient content claims, and health claims[J].Federal Register, 2003, 63(133): 41 434-41 506.

[2] KAVANAGHA K, SAJADIANA S, JENKINS K A, et al.Neonatal and fetal exposure to trans-fatty acids retards early growth and adiposity while adversely affecting glucose in mice[J].Nutrition Research, 2010, 30: 418-426.

[3] CHAVARRO J E,MNGUEZ-ALARCN L, MENDIOLA J, et al.Trans Fatty Acid Intake is Inversely Related to Total Sperm Count in Young Heathy Men[J].Hum Reprod, 2014, 9(3): 429-440.

[4] COLLISON K S, MAKOUL N J, INGLIS A, et al.Dietary trans-fat combined with monosodium glutamate induces dyslipidmia and impairs spatial memory[J].Physilogy& Behavior, 2010, 99: 334-342.

[5] 中华人民共和国卫生部.GB 10765—2010 食品安全国家标准 婴儿配方食品[S].北京: 中华人民共和国卫生部, 2010: 1.

[6] 中华人民共和国卫生部.GB 10767—2010 食品安全国家标准 较大婴儿和幼儿配方食品[S].北京: 中华人民共和国卫生部, 2010: 1.

[7] 中华人民共和国卫生部.GB 10769—2010 食品安全国家标准 婴幼儿谷类辅助食品[S].北京: 中华人民共和国卫生部, 2010: 1.

[8] RATOAYAKE W M N, PLOUFFE L J, PASQUIER E, et al.Temperature-sensitive resolution of cis-and trans-fatty acid isomers of partially hydrogenated vegetable oils on SP-2560 and CP-Sil 88 capillary columns[J].Journal of AOAC International, 2002, 85: 1 112-1 118.

[9] 娄峰阁, 陈晓婷, 陈哲, 等.齐齐哈尔市售乳制品中反式脂肪酸的测定[J].卫生研究, 2015, 44(5): 860-862.

[10] ADLOF R O, COPES L C, EMKEN E A.Analysis of monoenoic fatty acid distribution in Hydrogenated vegetable oils by silver-ion high performance liquid chromatography[J].J.Am.Oil Chem.Soc., 1995, 72(5): 571-574.

[11] 李蕊, 徐小民, 李亚利, 等.银离子固相萃取-气相色谱法检测乳脂肪中的反式脂肪酸[J].色谱, 2010, 28(12): 1 168-1 172.

[12] RATNAYAKE W M.Overview of methods for the determin-ation of trans fatty acids by GC,Silver-ion TLC, silver-ion LC, and GC/MS[J].J AAC Int, 2004, 87: 523-529.

[13] 袁慧君, 傅红, 铙平凡, 等.反脂肪酸红光谱和气相色谱分析[J].粮食与油脂, 2007(2): 40-42.

[14] 张琳, 杨圣岽, 吴海成, 等.反式脂肪酸的危害及其检测方法的研究现状[J].安徽农业科学, 2012, 40(20): 10 612-10 614.

[15] 祝伟霞, 杨冀州, 王彩娟, 等.毛细管气相色谱法测定食用油中15种反式脂肪酸的含量[J].理化检验: 化学分册, 2015, 51(3): 375-380.

[16] OLIVERIRA M A, SOLIS V E, GIOLELLI L A, et al.Method development for the analysis of trans-fatty acids in hydrogenated oils by capillary electrophoresis[J].Electropho-resis, 2003, 24: 1 641-1 647.

[17] 林麒, 李国波, 葛品, 等.气相色谱-质谱联用法检测母乳脂肪中反式脂肪酸[J].色谱, 2016, 34(5): 520-527.

[18] 郑爱榕, 郑雪红, 李文权, 等.螺旋藻脂肪酸随培养时间、温度和营养盐变化的研究[J].海洋学报, 2003, 25(2): 106-115.

[19] 宋立华, 李云飞, 汤楠.食品中反式脂肪酸的分析方法研究进展[J].上海交通大学学报: 农业科学版, 2007, 25(1): 81-84.

[20] 林旭彬.谈一谈“婴幼儿谷类辅助食品”风险监测项目“反式脂肪酸/总脂肪酸比值”的参考值[J].科技视界, 2015(36): 326.

[21] 王邱.国内外对膳食反式脂肪酸的研究概况[J].食品研究与开发, 2017, 38(9): 217-221.